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Fadenpilze sind mehrzellige, eukaryotische Organismen, die oft in großer Zahl im Boden vorkommen und eine wichtige Rolle im Ökosystem spielen. Pilze können isoliert, quantifiziert und im Labor untersucht werden.
Pilze sind in Oberflächenböden reichlich vorhanden und spielen eine wichtige Rolle beim Nährstoffkreislauf und der Zersetzung von organischer Substanz und Schadstoffen. Da sie nicht in der Lage sind, ihre eigene Nahrung zu synthetisieren, werden sie als heterotroph eingestuft und sind aerob und benötigen daher Sauerstoff.
Um Pilze zu kultivieren, werden Bodenproben in bekannten Konzentrationen in sterilem Wasser verdünnt, dann auf Agarplatten plattiert und inkubiert. Die entstehenden Pilzkolonien können dann gezählt und identifiziert werden.
Dieses Video veranschaulicht die Prinzipien hinter der Isolierung, Quantifizierung und Identifizierung von Fadenpilzen.
Böden enthalten in der Regel Millionen von Pilzen pro Gramm; Daher werden häufig serielle Verdünnungen verwendet, um Bodenproben für die Analyse vorzubereiten. Eine bestimmte Menge Erde wird einer Dispergierlösung zugesetzt. Aliquote der Suspension werden in Reihe in eine Pufferlösung überführt, bis die Suspension so verdünnt ist, dass diskrete Pilzkolonien wachsen können.
Diese Verdünnungen werden dann auf Agarmedien plattiert und inkubiert. Sobald sie sichtbare Pilzkolonien gebildet haben, können sie gezählt werden. Da davon ausgegangen wird, dass jede Pilzkolonie von einem einzigen Organismus abstammt, wird der Begriff "Colony Forming Units" (KBE) verwendet, um die Anzahl der Organismen auszudrücken, die pro Gramm trockenem Boden berechnet wird.
Die meisten Pilze wachsen als Hyphen, das sind lange, verzweigte Strukturen, die die Hauptart des vegetativen Wachstums sind. Ansammlungen von Hyphen werden als Myzel bezeichnet. Pilze können auch als einzellige Organismen existieren, wobei Hefe ein bekanntes Beispiel ist.
Die Vermehrung von Pilzen kann auf verschiedene Arten erfolgen. Hyphen produzierende Pilze können sich ungeschlechtlich, durch Fragmentierung von Hyphen oder von Stängeln mit samenartigen Sporen vermehren. Einzellige Pilze können sich ungeschlechtlich vermehren, indem sie knospen.
Pilze können sich auch sexuell vermehren. Dies ist seltener als asexuelle Fortpflanzung und tritt in der Regel als Reaktion auf ungünstige Umweltbedingungen auf. Bei Hyphen produzierenden Pilzen können zwei Fortpflanzungshyphen aus verschiedenen Pilzstämmen verschmelzen, wodurch eine Zygote entsteht. Bei einzelligen Pilzen verschmelzen zwei Zellen entgegengesetzter Stämme.
Fruchtbare Böden enthalten in der Regel im Bereich von 106 Pilzvermehrungen pro Gramm Trockengewicht. Propagulen sind Pilzsporen, Hyphen oder Hyphenfragmente. Die Verwendung von kultivierbaren Plattenzählungen ist eine schnelle, kostengünstige und reproduzierbare Technik, um den Pilzgehalt aufzuklären. Die Ergebnisse können jedoch durch die Tatsache verzerrt werden, dass nicht alle Organismen auf Medienplatten kultiviert werden.
Rosen-Bengal-Agarplatten mit Antibiotika, wie z. B. Streptomycin, werden typischerweise für Pilzkulturen verwendet. Da Bakterien in den meisten Böden viel zahlreicher sind als Pilze, selektiert das ideale Pilzmedium gegen das Bakterienwachstum und ermöglicht es den Pilzen, zu überleben. Rosen-Bengal-Farbstoff hemmt das Wachstum der meisten Bakterien und reduziert die Größe von Pilzkolonien. Dies ist ideal und verhindert das Überwachsen von Pilzplatten sowie die Bekämpfung von Bakterien.
Nachdem wir nun mit den Prinzipien hinter der Kultivierung von Fadenpilzen vertraut sind, werfen wir einen Blick darauf, wie dies im Labor durchgeführt wird.
Sobald die Bodenproben entnommen wurden, bringen Sie sie zur Analyse ins Labor. Berechnen Sie zunächst den Feuchtigkeitsgehalt des Bodens. Fügen Sie entionisiertes Wasser hinzu, um den Feuchtigkeitsgehalt auf 15 % zu bringen.
Decken Sie die Behälter mit Plastikfolie ab und befestigen Sie sie mit einem Gummiband, um die Verdunstung zu begrenzen. Durchstechen Sie die Folie mehrmals, um eine Belüftung zu ermöglichen.
Bodenprobe und Behälter wiegen und aufzeichnen. Eine Woche lang bei Raumtemperatur inkubieren, um das Wachstum der natürlich vorkommenden Pilze zu ermöglichen.
Wiegen Sie die Bodenproben und den Behälter erneut und notieren Sie das Gewicht. Berechnen Sie den Gewichtsverlust aufgrund des Feuchtigkeitsverlusts im Laufe der Woche. Geben Sie Wasser in den Boden, um das Gewicht wieder auf den ursprünglichen Wert zu bringen.
10 g feuchte Erde in 95 ml destilliertes Wasser geben und gründlich mischen. Dies ist die 10-1-Verdünnung, da 10 g Erde ein Volumen von etwa 5 ml haben. Führen Sie vier serielle Verdünnungen von 1 ml in 9 ml-Leerproben mit Wasser aus dieser Stammlösung durch.
Sammeln Sie als Nächstes acht sterile Rosen-Bengal-Streptomycin-Agar-Platten. Geben Sie 0,1 mL aus dem Verdünnungsröhrchen 10-2 zu zwei der Platten und verteilen Sie es mit einem mit Ethanolflamme sterilisierten Glasstreuer auf der Agaroberfläche. Da eine Menge von 0,1 mL plattiert wird, ergibt sich eine effektive Verdünnung von 10-3.
Inkubieren Sie diese Platten in einem dunklen Schrank bei Raumtemperatur eine Woche lang.
Zählen Sie nach einer Woche die einzelnen Kolonien auf jeder Platte. Platten mit 10 bis 20 Pilzkolonien sollten gezählt werden. Notieren und beschreiben Sie die Unterscheidungsmerkmale der Platten oder Kolonien.
Nehmen Sie einen sauberen Objektträger aus Glas und geben Sie einen Tropfen Lactophenol-Eindeckflüssigkeit in die Mitte. Schneiden Sie mit einer Pinzette einen etwa 3 cm langen Streifen durchsichtiges Zellophanband ab, um eine Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie bei Bedarf eine Präpariernadel, um das Band von der Pinzette zu lösen.
Bringen Sie die Klebeseite des Klebebandes auf die Oberfläche einer sporulierenden Pilzkolonie an und achten Sie darauf, dass kein übermäßiger Druck entsteht. Tragen Sie anschließend die Klebeseite des Klebebandes mit der Sporenprobe auf die Montageflüssigkeit auf dem Objektträger auf. Reiben Sie das Tape vorsichtig mit einem glatten, flachen Instrument, um Luftblasen zu entfernen.
Untersuchen Sie die Bandhalterung unter einem leistungsstarken Objektiv.
Pilze können mikroskopisch durch Untersuchung der Fruchtkörper und Sporen identifiziert werden. Ein Schlüssel zur Identifizierung von Pilzen kann diesen Prozess unterstützen. Zu den häufig beobachteten Pilzarten gehören Penicillium und Aspergillus.
Mit Hilfe der Platten können die Pilze mit der gleichen Technik wie mit der bakteriellen Zählung gezählt werden.
Die Identifizierung und Kultivierung von Pilzen ist für eine Vielzahl von wissenschaftlichen Anwendungen nützlich.
Branchen wie Zellstoff- und Papierherstellungsanlagen können filamentöse Pilze verwenden, um Holz in ihrem Zellstoffprozess zu zersetzen, in einer Technik, die als Biopulping bekannt ist. Pilze wie Weißfäule können Hackschnitzel effizient abbauen, was zu einem geringeren Bedarf an chemischem oder mechanischem Aufschluss führt.
Pilze können auch verwendet werden, um andere Materialien abzubauen, einschließlich bestimmter Arten von biologisch abbaubaren Kunststoffen. Dies kann für landwirtschaftliche oder gartenbauliche Anwendungen nützlich sein, bei denen biologisch abbaubare Mulchfolien verwendet werden können, um vorübergehende Barrieren gegen unerwünschtes Pflanzenwachstum zu schaffen.
Pilze sind auch Produzenten von Antibiotika, Verbindungen, die die Medizin im 20. Jahrhundert revolutioniert haben und auch heute noch eine vorderste Verteidigungslinie bei Infektionen darstellen. Penicillin, ein weit verbreitetes Antibiotikum, wurde aus dem weit verbreiteten Fadenpilz Penicillium rubens isoliert. Bis heute werden Fadenpilze isoliert und auf der Suche nach neuen Antibiotika untersucht.
Sie haben gerade die Einführung von JoVE in filamentöse Pilze gesehen. Sie sollten nun verstehen, wie man filamentöse Pilze aus dem Boden kultiviert, wie man sie quantifiziert und wie man Pilzarten identifiziert, die häufig im Boden vorkommen. Danke fürs Zuschauen!
