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Advanced Biology

Transformation von E. coli-Zellen mit einem adaptierten Calciumchlorid-Verfahren

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Microbiology

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Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

6.9: Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

6.11: Conjugation: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

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10:54 min

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April 30, 2023

Overview

Quelle: Natalia Martin¹, Andrew J. Van Alst¹, Rhiannon M. LeVeque¹, und Victor J. DiRita¹
¹ Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University

Bakterien haben die Fähigkeit, genetisches Material (DeoxyriboNucleic Acid, DNA) in einem Prozess auszutauschen, der als horizontaler Gentransfer bekannt ist. Die Einbeziehung exogener DNA bietet einen Mechanismus, mit dem Bakterien neue genetische Merkmale erwerben können, die es ihnen ermöglichen, sich an sich verändernde Umweltbedingungen anzupassen, wie das Vorhandensein von Antibiotika oder Antikörpern (1) oder Molekülen, die in natürlichen Lebensräumen gefunden werden (2). Es gibt drei Mechanismen des horizontalen Gentransfers: Transformation, Transduktion und Konjugation (3). Hier konzentrieren wir uns auf transformation, die Fähigkeit von Bakterien, freie DNA aus der Umwelt zu nehmen. Im Labor hat der Transformationsprozess vier allgemeine Schritte: 1) Vorbereitung kompetenter Zellen, 2) Inkubation kompetenter Zellen mit DNA, 3) Wiederherstellung der Zellen und 4) Beschichtung der Zellen für das Wachstum der Transformanten (Abbildung 1).

Abbildung 1: Allgemeine Schritte des Transformationsprozesses. Der Transformationsprozess besteht aus vier allgemeinen Schritten: 1) Vorbereitung kompetenter Zellen, 2) Inkubation mit DNA, 3) Wiederherstellung der Zellen und 4) Beschichtungszellen für das Wachstum der Transformanten.

Damit die Transformation stattfindet, müssen sich die Empfängerbakterien in einem Zustand befinden, der als Kompetenz bekannt ist. Einige Bakterien haben die Fähigkeit, natürlich kompetent als Reaktion auf bestimmte Umweltbedingungen zu werden. Jedoch, viele andere Bakterien werden nicht kompetent natürlich, oder die Bedingungen für diesen Prozess sind noch unbekannt. Die Fähigkeit, DNA in Bakterien einzuführen, hat eine Reihe von Forschungsanwendungen: mehrere Kopien eines DNA-Moleküls von Interesse zu erzeugen, eine große Menge an Proteinen auszudrücken, als Bestandteil in Klonverfahren, und andere. Aufgrund des Wertes der Transformation zur Molekularbiologie gibt es mehrere Protokolle, die darauf abzielen, Zellen künstlich kompetent zu machen, wenn Bedingungen für natürliche Kompetenz unbekannt sind. Zwei Hauptmethoden werden verwendet, um künstlich kompetente Zellen vorzubereiten: 1) durch chemische Behandlung von Zellen und 2) Die Zellen elektrischen Impulsen aussetzen (Elektroporation). Erstere verwendet je nach Verfahren unterschiedliche Chemikalien, um Anziehungskraft zwischen der DNA und der Zelloberfläche zu erzeugen, während letztere elektrische Felder verwendet, um Poren in der bakteriellen Zellmembran zu erzeugen, durch die DNA-Moleküle eindringen können. Der effizienteste Ansatz für die chemische Kompetenz ist die Inkubation mit divalenten Kationen, insbesondere Kalzium (Ca²⁺⁾(4,5) Calcium-induzierte Kompetenz ist das Verfahren, das hier beschrieben wird (6). Diese Methode wird hauptsächlich für die Transformation von Gram-negativen Bakterien verwendet, und das wird der Schwerpunkt dieses Protokolls sein.

Das Verfahren der chemischen Umwandlung umfasst eine Reihe von Schritten, in denen Zellen Kationen ausgesetzt sind, um chemische Kompetenz zu induzieren. Auf diese Schritte folgt anschließend eine Temperaturänderung – Hitzeschock -, die die Aufnahme fremder DNA durch die zuständige Zelle begünstigt (7). Die bakteriellen Zellhüllen sind negativ geladen. Bei gramnegativen Bakterien wie Escherichia coliist die äußere Membran aufgrund des Vorhandenseins von Lipopolysaccharid (LPS) negativ geladen (8). Dies führt zur Abstoßung der ähnlich negativ geladenen DNA-Moleküle. In der chemischen Kompetenzinduktion neutralisieren positiv geladene Calciumionen diese Ladungsabstoßung und ermöglichen die DNA-Absorption auf die Zelloberfläche (9). Die Kalziumbehandlung und Inkubation mit DNA erfolgt auf Eis. Anschließend wird eine Inkubation bei höheren Temperaturen (42°C), dem Hitzeschock, durchgeführt. Dieses Temperaturungleichgewicht begünstigt die DNA-Aufnahme weiter. Bakterielle Zellen müssen sich in der mittleren exponentiellen Wachstumsphase befinden, um der Hitzeschockbehandlung standzuhalten; in anderen Wachstumsstadien sind die Bakterienzellen zu empfindlich gegenüber der Hitze, was zu einem Verlust der Lebensfähigkeit führt, was die Transformationseffizienz deutlich verringert.

Für die Transformation können verschiedene DNA-Quellen verwendet werden. Typischerweise werden Plasmide, kleine kreisförmige, doppelsträngige DNA-Moleküle, für die Transformation in den meisten Laborverfahren in E. coli verwendet. Damit Plasmide nach der Transformation in der Bakterienzelle erhalten bleiben können, müssen sie einen Ursprung der Replikation enthalten. Dadurch können sie unabhängig vom bakteriellen Chromosom in der Bakterienzelle repliziert werden. Nicht alle Bakterienzellen werden während des Transformationsvorgangs transformiert. So ergibt die Transformation eine Mischung aus transformierten Zellen und nicht transformierten Zellen. Um zwischen diesen beiden Populationen zu unterscheiden, wird eine Selektionsmethode verwendet, um die Zellen zu identifizieren, die das Plasmid erworben haben. Plasmide enthalten in der Regel wählbare Marker, d. h. Gene, die eine Eigenschaft kodieren, die einen Vorteil für das Wachstum verleiht (d. h. Resistenz gegen ein Antibiotikum oder eine Chemikalie oder Rettung aus einer Wachstumsauxotrophie). Nach der Transformation werden Bakterienzellen auf selektiven Medien plattiert, was nur das Wachstum der transformierten Zellen ermöglicht. Im Falle von Zellen, die mit einem Plasmid transformiert werden, das eine Resistenz gegen ein bestimmtes Antibiotikum verleiht, werden die selektiven Medien Wachstumsmedien sein, die dieses Antibiotikum enthalten. Verschiedene Methoden können verwendet werden, um zu bestätigen, dass die in den selektiven Medien angebauten Kolonien Transformanten sind (d.h. das Plasmid eingebaut haben). Beispielsweise können Plasmide aus diesen Zellen mit Plasmidpräparationsmethoden (10) zurückgewonnen und verdaut werden, um die Plasmidgröße zu bestätigen. Alternativ kann Kolonie-PCR verwendet werden, um das Vorhandensein des Plasmids von Interesse zu bestätigen (11).

Ziel dieses Experiments ist es, chemisch kompetente E. coli DH5-Zellen unter Verwendung einer Anpassung des Calciumchloridverfahrens (12) vorzubereiten und mit dem Plasmid pUC19 zu transformieren, um die Transformationseffizienz zu bestimmen. Der E. coli-Stamm DH5 ist ein häufig verwendeter Stamm in molekularbiologischen Anwendungen. Aufgrund seines Genotyps, insbesondere des recA1 und des endA1,ermöglicht dieser Stamm eine erhöhte Insert-Stabilität und verbessert die Qualität der Plasmid-DNA in nachfolgenden Präparaten. Da die Transformationseffizienz mit zunehmender Größe der DNA abnimmt, wurde das Plasmid pUC19 in diesem Protokoll wegen seiner geringen Größe (2686 bp) verwendet (siehe https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html für eine Vektorkarte). pUC19 verleiht Resistenz gegen Ampicillin und somit war dies das Antibiotikum, das zur Selektion verwendet wurde.

Procedure

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Umwandlung des kompetenten E. coli DH5 mit Hilfe einer Anpassung des Calciumchloridverfahrens (12).

1. Einrichtung

ausrüstung
- Spektrophotometer
- Sorval zentrifuge (oder gleichwertig)
- Benchtop Zentrifuge
- Wärmeblock oder Wasserbad
- Orbital Shaker
- Stationärer Inkubator
- Gelgussschale
- Gut Kämme
- Spannungsquelle
- Gel-Box
- UV-Lichtquelle
- mikrowelle
Lösungen und Reagenzien
- Luria-Bertani (LB) Brühe (10 g Kaseinenzymhydrolysat, 5 g Hefeextrakt und 5 g Natriumchlorid in 1000 ml_H2O)
- Super optimale Brühe mit Katabolitenrepression (SOC): (2% (w/v) Trypton, 0,5% (w/v) Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄und 20 mM Glukose)
- CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂) Lösung.
- M CaCl₂ Lösung (wenn Zellen sofort transformiert werden) oder 0,1M CaCl₂ Lösung mit 10% (v/v) Glycerin (wenn Zellen für die zukünftige Verwendung eingefroren werden).
- LB AgarPlatten
- LB Agar selektive Platten (für dieses Experiment, da das verwendete Plasmid konfers Ampicillin-Resistenz, LB-Agar-Platten mit Ampicillin 100 g/ml verwendet wurden)
- E. coli DH5-Stamm
- Plasmid pUC19 DNA (100 pg/ l)
- QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)
- Hind III-Restriktionsenzym
- 1 kb plus DNA-Leiter
- Niedriger Schmelzpunkt Agarose
- 1X TAE Puffer (40 mM Tris Base, 20 mMM Essigsäure und 1mM EDTA)
- Ethidiumbromid (10mg/ml)
Allgemeine Sicherheitshinweise
E. coli DH5 wird als Biosafety Level 1 (BSL1) klassifiziert. Mikroben in dieser Kategorie stellen bei gesunden Erwachsenen wenig bis gar keine Infektionsgefahr dar. Eine sorgfältige Manipulation des Mikroorganismus ist jedoch erforderlich.

WICHTIG alle Schritte in diesem Protokoll müssen mit aseptischen Techniken und auf Eis oder 4°C Temperaturen durchgeführt werden, sofern nicht angegeben.

2. Protokoll

Aus einem gefrorenen Vorrat an E. coli DH5 (gefroren in 20% Glycerin aus einer über Nacht kultur in LB angebaut) streifen Bakterien für die Isolierung auf einer LB Agarplatte. Inkubieren Bei 37°C über Nacht (16-20 Stunden).
Impfen Sie eine einzelne Kolonie in 3 ml LB-Brühe in einer Röhre. Schütteln bei 210 Rpm bei 37°C über Nacht (16-20 Stunden).
Messen Sie die OD600 der Übernachtungskultur. Verwenden Sie die Nachtkultur, um 100 ml LB-Brühe in einem 1-Liter-Kolben zu einem OD600=0.01 zu impfen. Bebrüte die Kultur kräftig (210 Rpm) bei 37°C und überwacht OD600 im Spektralphotometer alle 15-20 min, bis die Kultur OD600=0,35 (ca. 3 Stunden) erreicht.
HINWEIS: Damit die Transformation effizient ist, müssen sich Bakterienzellen in einer mittleren exponentiellen Wachstumsphase befinden. Die maximale Anzahl der Zellen muss 10⁸ Zellen/ml betragen, was für die meisten Stämme von E. coli OD600=0.4 entspricht. Die Verwendung des Spektralphotometers ermöglicht die Messung des OD600, wodurch festgestellt werden kann, dass sich die Zellen in der entsprechenden Wachstumsphase befinden. Wenn dieses Protokoll für andere Bakterienstämme verwendet wird, ist eine Kalibrierung erforderlich, um die Anzahl der Kolonien zu bestimmen, die Einheiten zu bestimmten OD600-Werten bilden, um diese Korrelation zu bestimmen.
Übertragen Sie die 50 ml der Kultur auf jede der 2 eiskalten Polypropylen-Zentrifugenflaschen. Die Flaschen 20 min auf Eis legen, um sie abzukühlen.
Die Zellen durch Zentrifugation bei 2700g (4100 U/min in einem Sorval GSA Rotor) für 10 min bei 4°C wiederherstellen.
Entfernen Sie den Überstand. Entleeren Sie die letzten Medienspuren, indem Sie die Flasche kopfüber auf ein Pad oder Papiertuch legen.
Setzen Sie jedes bakterielle Pellet in 30 ml einer CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂) eiskalte Lösung aus. Zuerst 5 ml der Lösung hinzufügen, vorsichtig wirbeln, bis sich das Pellet vollständig aufgelöst hat, und dann die restlichen 25 ml Lösung hinzufügen.
Wiederholen Sie Schritt 2.4.
Wiederholen Sie Schritt 2.5.
Wenn kompetente Zellen direkt umgewandelt werden, setzen Sie jedes bakterielle Pellet in 2 ml einer ca.₂ (0,1 m) eiskalten Lösung aus, indem Sie die Rohre vorsichtig wirbeln. Wenn das Pellet mit dieser Methode nicht resuspendiert wird, resuspendieren Sie durch sanftes Pipettieren nach oben und unten (Vermeidung von Blasenbildung).
Alternativ können die kompetenten Zellen eingefroren und zur späteren Verwendung gelagert werden. Um gefrorene Bestände kompetenter Zellen zu zuzubereiten, setzen Sie das Pellet in 2 ml einer 0,1 Mio._{CaCl2-Lösung} mit 10 % (v/v) Glycerin wieder aus. Diese Lösung muss eiskalt sein. Aliquot-Zellsuspension in eiskalte 1,5 ml Polypropylenröhren (160 l pro Röhre). Kompetente Zellen sofort in einem Trockeneis/Ethanolbad einfrieren. Rohre in einen -70°C Gefrierschrank übertragen.
Um die CaCl_{2-behandelten}Zellen zu transformieren, übertragen Sie 50 l kompetente Zellen auf jeweils 2 1,5 ml Polypropylen-Röhrchen. Fügen Sie die 1 l (100 pg) pUC19 Plasmid-DNA in eines der Röhrchen hinzu und lassen Sie die zweite Röhre ohne DNA (negative Kontrolle). Mischen Sie sanft (Blasenbildung vermeiden). 30 min auf Eis bebrüten.
HINWEIS: Bei der Transformation sollten nicht mehr als 50 ng DNA in einem Volumen von 10 l oder weniger verwendet werden.
Übertragen Sie die Rohre auf den Wärmeblock und inkubieren Bei 42°C für 45 s genau.
HINWEIS: Hitzeschock ist ein kritischer Schritt. Temperatur oder Inkubationszeit nicht überschreiten.
Rohre leicht auf Eis übertragen. Inkubieren Sie für 2 min.
Fügen Sie 950 L SOC-Medien hinzu und inkubieren Sie die Röhren 1 Stunde bei 37°C, damit sich die Bakterien erholen und den im Plasmid kodierten antibiotikaresistenten Marker ausdrücken können.
Verdünnung von 10 l der Zellsuspension in 1000 l in SOC (1/100 Verdünnung) und 100 l der Zellsuspension in 1000 l in SOC (1/10 Verdünnung). Platte 100 l der Verdünnungen sowie die Kontrolle auf selektive Platten und mit einem Spachtel verteilen. In der Regel ergibt die Beschichtung von 100 l einer Verdünnung von 1/100 und 1/10 eine ausreichende Anzahl von koloniebildenden Einheiten (cfu) pro Platte. Idealerweise sollte diese Zahl zwischen 30-300 cfu liegen, so dass es genügend Kolonien gibt, aber voneinander getrennt sind. Die Anzahl der cfu hängt jedoch von der Transformationseffizienz ab (siehe Abschnitt Datenanalyse und Ergebnisse).
Inkubieren Sie die Platten bei 37°C. Transformierte Kolonien sollten in 12-16 Stunden erscheinen (dieser Bereich hängt von der Zellstamm- und Selektionsmethode ab). Keine Kolonien sollten in der negativen Kontrolle wachsen.
Zählen Sie die für die Transformation erhaltene cfu/platte (Tabelle 1).
Um zu überprüfen, ob die Transformanten das pUC19-Plasmid enthalten, wird ein Plasmidpräparat und eine anschließende Verdauung durchgeführt. Zu diesem Zweck eine einzelne Kolonie in 3 ml LB-Brühe in einer Röhre impfen. Schütteln bei 210 Rpm bei 37°C über Nacht (16-20 Stunden).
Bereiten Sie ein Plasmid-Präparat mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit nach den Anweisungen des Herstellers vor.
Verdauen Sie die 1 g gereinigte pUC19 mit dem Restriktionsenzym HindIII bei 37°C für 1 Stunde.
HINWEIS: Für diesen Schritt kann jedes Enzym verwendet werden, das die mehrfache Klonstelle pUC19 schneidet.

teil	betrag
10X Einschränkung Digest-Puffer	2,5 l
Plasmid pUC19	1 g
Hind Ⅲ	1 l
H₂O	20,5 l (bis 25 l)

Führen Sie eine Molekulargewichtsleiter, verdaute pUC19-DNA und die gleiche Menge an unverdauter pUC19-DNA in einem 1% Agarose-Gel, das 1 g/ml Ethidiumbromid enthält, 1 Stunde lang bei 95 V.
HINWEIS: Zeit und Spannung variieren je nach verwendeter Ausrüstung.
Visualisieren Sie Gel unter UV-Licht. Vergleichen Sie die Größe der verdauten und unverdauten pUC19-DNA (Abbildung 2) (siehe Abschnitt Datenanalyse und Ergebnisse).
Fahren Sie mit den erforderlichen Schritten fort, um die Transformation entsprechend dem Ziel jedes einzelnen Transformationsexperiments zu überprüfen.

Abbildung 2: Verdauung der wiedergewonnenen Plasmid-DNA aus transformierten DH5-Zellen. Plasmid-DNA wurde aus transformierten DH5-Zellen, die mit HindIII verdaut, in einem 1% Agarose-Gel verdaute und mit einer UV-Quelle visualisiert wurden (Schritte 2.19 bis 2.22), wiederhergestellt.

3. Datenanalyse und Ergebnisse

Um die Transformationseffizienz zu berechnen, ein Indikator dafür, wie gut die Zellen die extrazelluläre DNA aufgriffen, müssen die kolonien gezählt werden, die bei der Transformation erhalten wurden:

verdünnung	Cfu
1/100	34
1/10	246

Tabelle 1: Koloniebildnereinheiten (cfu) aus Transformationsexperiment gezählt.

Die Transformationseffizienz (TE) ist ein Maß für die Anzahl der cfu, die sich aus der Umwandlung von 1 g Plasmid in ein bestimmtes Volumen kompetenter Zellen ergibt. Viele Parameter beeinflussen die Transformationseffizienz: Plasmidgröße, Zellgenotyp, Wachstumsstadium bei der Kompetenzvorbereitung, Transformationsmethoden usw.). Bei der Berechnung des TE ist es wichtig zu berücksichtigen, welche Verdünnung (falls vorhanden) vor der Beschichtung durchgeführt wurde, und sie in die Berechnung der Gesamtzahl der Cfu einzubeziehen. Die Transformationseffizienz (TE) wird mit der folgenden Gleichung berechnet:

Teilen Sie zunächst den Cfu durch die DNA, in diesem Beispiel 0,0001 g. Dividieren Sie dann das Ergebnis durch den Verdünnungsfaktor. In diesem Beispiel wurde eine Verdünnung von 1/10 und 100 l einer 1 ml-Lösung plattiert (Verdünnung: 1/10 x 100 l /1000 l =0,01).

Bakterien sind bemerkenswert anpassungsfähig und ein Mechanismus, der diese Anpassung erleichtert, ist ihre Fähigkeit, externe DNA-Moleküle aufzunehmen. Eine Art von DNA, die Bakterien aufnehmen können, wird als Plasmid bezeichnet, ein kreisförmiges Stück DNA, das häufig nützliche Informationen enthält, wie Antibiotikaresistenzgene. Der Prozess der Veränderung von Bakterien durch neue genetische Informationen aus einer externen Quelle wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation kann leicht im Labor mit Escherichia coli oder E. colidurchgeführt werden.

Um transformiert zu werden, müssen E. coli-Zellen zunächst kompetent gemacht werden, was bedeutet, dass sie DNA-Moleküle aus ihrer Umgebung aufnehmen können. Das Protokoll dazu ist überraschend einfach, eine kurze Inkubation der Zellen in einer Calciumchloridlösung. Diese Inkubation bewirkt, dass die Zellen für DNA-Moleküle durchlässig werden. Nachdem die Zellen durch Zentrifugation pelletiert wurden, wird der Überstand entfernt. Die Plasmid-DNA wird nun den zuständigen Zellen zugesetzt. Nach der Inkubation der Zellen mit DNA wird die Mischung kurz auf 42 Grad Celsius erhitzt, gefolgt von einer schnellen Abkühlung auf Eis. Dieser Hitzeschock bewirkt, dass die DNA über die Wand und die Membranen der Zelle übertragen wird. Die Zellen werden dann in frischen Medien inkubiert. Dann werden die Bakterien auf 37 Grad platziert, damit sie ihre Membranen wieder versiegeln und resistente Proteine ausdrücken können.

Die Zellen, die die Plasmide aufgenommen haben, kopieren die DNA originalgetreu und geben sie an ihre Nachkommen weiter und geben alle Proteine aus, die von ihr kodiert werden könnten, einschließlich Antibiotikaresistenzvermittlern. Diese Resistenzgene können als wählbare Marker verwendet werden, um Bakterien zu identifizieren, die erfolgreich transformiert wurden, weil Zellen, die das Plasmid nicht aufgenommen haben, das Resistenzgenprodukt nicht ausdrücken. Das bedeutet, dass nur Zellen wachsen, die das Plasmid aufgenommen haben, wenn die Zellen auf einem festen Medium plattiert sind, das das entsprechende Antibiotikum enthält. Die Transformation der Zellen in einer wachsenden Kolonie kann weiter bestätigt werden, indem diese Zellen über Nacht in flüssigen Medien kultiviert werden, um die Ausbeute zu erhöhen, bevor die DNA aus der Probe extrahiert wird. Sobald die DNA isoliert ist, kann ein diagnostisches Restriktionsenzym-Digest durchgeführt werden. Da Restriktionsenzyme DNA an vorhersehbaren Stellen schneiden, sollte das Ausführen dieser Digests auf einem Gel ein vorhersagbares Muster aufweisen, wenn das gewünschte Plasmid erfolgreich transformiert wurde. Wenn z. B. pUC19 mit dem Restriktionsenzym HindIII hergestellt und geschnitten wird, sollte ein einzelnes Band von 2686 Nukleotiden auf dem Gel zu sehen sein.

In diesem Labor transformieren Sie den E. coli-Stamm DH-5 Alpha mit pUC19 und bestätigen dann die erfolgreiche Transformation durch DNA-Gelelektrophorese.

Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, ziehen Sie die entsprechende persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich laborierter Kleidung und Handschuhe. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol.

Bereiten Sie nun chemisch kompetente Zellen vor, indem Sie eine Schleife voller Bakterien auf eine sterile LB-Agarplatte ablagern und die Bakterien mit einer neuen Schleife sättigen. Dann bebrüten Sie die Platte bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag die Bankplatte wieder mit 70% Ethanol sterilisieren und die Platte aus dem Inkubator entfernen.

Impfen Sie eine einzelne, gut isolierte Kolonie in 3 Milliliter LB-Brühe in einem Rohr mit einer sterilen Schleife. Dann wachsen Die Kultur bei 37 Grad Celsius über Nacht, mit Schütteln bei 210 RPM. Messen Sie am nächsten Tag die optische Dichte der Übernachtungskultur mit einem Spektralphotometer. Dann 100 Milliliter LB-Brühe in einen Ein-Liter-Kolben geben und mit der Nachtkultur bei einer optischen Dichte von 0 impfen. 01. Bebrüte nun die Kultur bei 37 Grad Celsius mit Schütteln und prüfe die OD600 alle 15 bis 20 Minuten, bis die Kultur die mittelexponentielle Wachstumsphase erreicht.

Nach ca. drei Stunden 50 Milliliter der Kultur auf zwei eiskalte Polypropylenflaschen übertragen. Dann legen Sie die Flaschen wieder auf Eis für 20 Minuten zu kühlen. Als nächstes, erholen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entsorgen Sie die Überräube und legen Sie die Flaschen auf einem Papiertuch auf den Kopf. Als nächstes das bakterielle Pellet in fünf Millilitere eiskalte Calciumchlorid-Magnesiumchloridlösung wieder aufsetzen und vorsichtig wirbeln, bis sich das Pellet vollständig aufgelöst hat. Dann fügen Sie weitere 25 Milliliter der Lösung auf das gelöste bakterielle Pellet. Setzen Sie das andere bakterielle Pellet wieder aus, wie zuvor gezeigt. Danach wiederholen Sie die Zentrifugation, und entfernen Sie die Überstande.

Wenn die zuständigen Zellen direkt transformiert werden, setzen Sie jedes bakterielle Pellet in zwei Millilitern einer eiskalten 0,1 Molkalziumchloridlösung wieder auf, indem Sie die Schläuche vorsichtig wirbeln. Um das Transformationsverfahren zu beginnen, übertragen Sie 50 Mikroliter kompetenter Zellen auf zwei beschriftete 1,5 Milliliter Polypropylenröhren. Fügen Sie dann einem der Röhren einen Mikroliter pUC19-Plasmid-DNA hinzu. Mischen Sie sanft, Vermeiden Blasenbildung, und inkubieren beide Rohre für 30 Minuten auf Eis. Nach der Inkubation die Rohre in einen Wärmeblock geben und 45 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius brüten. Die Rohre sofort auf Eis übertragen und zwei Minuten bebrüten. Fügen Sie nun 950 Mikroliter SOC-Medien in jede Röhre und inkubieren Sie sie für eine Stunde bei 37 Grad Celsius, damit sich die Bakterien erholen können, und drücken Sie den antibiotikaresistenten Marker aus, der im Plasmid kodiert ist.

Um eine Verdünnung von 1 bis 100 herzustellen, fügen Sie 990 Mikroliter SOC-Medien und 10 Mikroliter Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Rohr ein. Dann machen Sie eine 1 bis 10 Verdünnung durch Zugabe von 900 Mikroliter SOC-Medien und 100 Mikroliter Zellsuspension zu einem 1,5 Milliliter-Rohr. Als nächstes 100 Mikroliter der verdünnten Zellsuspensionen und 100 Mikroliter der Negativkontrolle auf separate selektive Platten, die Ampicillin enthalten, mit einem Streuer und bebrüten die Platten 12 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie nach der Inkubation die koloniebildenden Einheiten oder KBE pro Platte, die durch Transformation erhalten wurden, und erfassen Sie diese Daten. Um zu überprüfen, ob die Transformanten das pUC19-Plasmid haben, wählen Sie eine einzelne, gut isolierte Kolonie aus einer Platte mit einer sterilen Schleife und führen Sie sie in ein Rohr mit 3 MilliliterN LB-Brühe ein. Dann bebrüten die Kultur bei 37 Grad Celsius mit Schütteln, über Nacht. Verwenden Sie am nächsten Tag ein DNA-Mini-Vorbereitungskit, um DNA aus 3 Millilitern der Kultur zu isolieren, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach Abschluss der DNA-Mini-Vorbereitung verdauen Sie das 1 Mikrogramm gereinigtes pUC19 mit einem Restriktionsenzym bei 37 Grad Celsius für 1 Stunde. Laden Sie nun 20 Mikroliter einer Molekulargewichtsleiter, 1 Mikrogramm verdauter Plasmid-DNA und 1 Mikrogramm unverdauter Plasmid-DNA in aufeinander folgende Brunnen eines 1% Agarose-Gels, das 1 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid enthält. Dann laufen Sie das Gel für 1 Stunde bei 95 Volt. Schließlich visualisieren Sie das Gel mit einem UV-Beleuchtung.

In diesem Experiment wurden e. coli DH5 Alpha chemisch kompetente Zellen mittels einer Anpassung des Calciumchloridverfahrens hergestellt und dann mit dem Plasmid pUC19 transformiert, um die Transformationseffizienz zu bestimmen. Um die Transformationseffizienz zu berechnen, verwenden Sie die aufgezeichneten KBE-Zahlen für die 1 in 100 und 1 in 10 Verdünnungen, und alle anderen Verdünnungen mit KBE zählt zwischen 30 und 300. Erstens wird die aufgezeichnete KBE-Zahl, 246 in diesem Beispiel, durch die Menge der DNA geteilt, .0001 Mikrogramm hier, die plattiert wurde. Dann wird diese Zahl durch den Verdünnungsfaktor dividiert, der verwendet wird, um die Umwandlungseffizienz in KBE pro Mikrogramm zu geben. In diesem Beispiel wurde eine Verdünnung von 1 bis 10 und 100 Mikroliter einer 1-Milliliter-Lösung plattiert, was einen endgültigen Verdünnungsfaktor von 0,01 ergibt. In der unverdauten Plasmidspur kann die kreisförmige DNA als zwei oder drei verschiedene Bänder unterschiedlicher Helligkeit erscheinen. Dies liegt daran, dass die kreisförmige, ungeschnittene DNA in mehreren verschiedenen Konformationszuständen existieren kann, z. B. in übereinander geschraubten, offenen Kreisen oder linearer, und jede dieser DNA bewegt sich mit unterschiedlichen Raten durch das Gel. Die Analyse der wiedergewonnenen Plasmid-DNA-Verdauung ergab, dass das verwendete Plasmid eine erwartete Größe von pUC19 DNA hat, 2.686 Basenpaare.

Results

Obwohl TE von vielen Faktoren abhängig ist, ergeben nicht-kommerzielle, kompetente Zellpräparate wie dieser normalerweise 10⁶ bis 10⁷ Transformanten pro Mikrogramm Plasmid. Daher ergab diese Zubereitung mit einem TE = 2,46 x 10⁸ cfu/g einen TE, der weit über den erwarteten Bereich hinausging. Zusätzliche Protokolle stehen zur Verfügung, um überkompetente Zellen herzustellen, wenn für eine bestimmte Anwendung höhere Transformationseffizienzen erforderlich sind (13).

Die Analyse der Verdauung der aus den transformierten Zellen gewonnenen Plasmid-DNA ergab, dass dieses Plasmid die erwartete Größe der pUC19-DNA (2686 bp) hat.

Applications and Summary

Transformation ist eine leistungsfähige Methode zur Einführung von exogener DNA in Bakterienzellen, die für viele molekularbiologische Anwendungen im Labor von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle in der Natur, indem es Bakterienzellen erlaubt, genetisches Material auszutauschen, was zu einer erhöhten genetischen Variation führen und den Erwerb verschiedener nützlicher Merkmale für das Überleben unter einer Vielzahl von Bedingungen ermöglichen könnte. Viele Bakterienstämme kodieren die Gene, die für die natürliche Kompetenz erforderlich sind. Die Bedingungen, unter denen diese Gene induziert werden, sind jedoch noch unbekannt. Weitere Forschung ist erforderlich, um diese Bedingungen zu bestimmen.

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Transcript

Bacteria are remarkably adaptable and one mechanism which facilitates this adaptation is their ability to take in external DNA molecules. One type of DNA that bacteria can uptake is called a plasmid, a circular piece of DNA that frequently contains useful information, such as antibiotic resistance genes. The process of bacteria being modified by new genetic information incorporated from an external source is referred to as transformation. Transformation can easily be performed in the laboratory using Escherichia coli, or E. coli.

In order to be transformed, E. coli cells must first be made competent, which means capable of taking in DNA molecules from their environment. The protocol for accomplishing this is surprisingly simple, a short incubation of the cells in a calcium chloride solution. This incubation causes the cells to become permeable to DNA molecules. After the cells are pelleted by centrifugation, the supernatant is removed. The plasmid DNA is now added to the competent cells. After incubating the cells with DNA, the mix is briefly heated to 42 degrees Celsius, followed by rapid cooling on ice. This heat shock causes the DNA to be transferred across the cell’s wall and membranes. The cells are then incubated in fresh media. Then, the bacteria are placed at 37 degrees to allow them to reseal their membranes and express resistant proteins.

Those cells which have taken in the plasmids will faithfully copy the DNA and pass it to their progeny and express any proteins that might be encoded by it, including antibiotic resistance mediators. Those resistance genes can be used as selectable markers to identify bacteria which have been successfully transformed because cells that have not taken up the plasmid will not express the resistance gene product. This means that when the cells are plated on a solid medium which contains the appropriate antibiotic, only cells that have taken up the plasmid will grow. Transformation of the cells in a growing colony can be further confirmed by culturing those cells in liquid media overnight to increase the yield before extracting the DNA from the sample. Once the DNA is isolated, a diagnostic restriction enzyme digest can be carried out. Because restriction enzymes cut DNA in predictable locations, running these digests on a gel should show a predictable pattern if the desired plasmid was successfully transformed. For example, if pUC19 is prepared and cut with the restriction enzyme HindIII, a single band of 2686 nucleotides should be seen on the gel.

In this lab, you will transform E. coli strain DH-5 Alpha with pUC19, and then confirm the successful transformation by DNA gel electrophoresis.

Before starting the procedure, put on the appropriate personal protective equipment, including a lab coat and gloves. Next, sterilize the workspace with 70% ethanol.

Now, prepare chemically competent cells by depositing a loopfull of bacteria onto a sterile LB agar plate and streaking the bacteria with a new loop. Then, incubate the plate at 37 degrees Celsius overnight. The next day, sterilize the bench top with 70% ethanol again, and remove the plate from the incubator.

Inoculate a single, well-isolated colony into 3 milliliters of LB broth in a tube with a sterile loop. Then, grow the culture at 37 degrees Celsius overnight, with shaking at 210 RPM. The next day, measure the optical density of the overnight culture with a spectrophotometer. Then, add 100 milliliters of LB broth to a one-liter flask, and inoculate it with the overnight culture at an optical density of 0. 01. Now, incubate the culture at 37 degrees Celsius with shaking, and check the OD600 every 15 to 20 minutes until the culture reaches mid-exponential growth phase.

After approximately three hours, transfer 50 milliliters of the culture to two ice-cold polypropylene bottles. Then, place the bottles back on ice for 20 minutes to cool. Next, recover the cells via centrifugation. Discard the supernatants and place the bottles upside down on a paper towel. Next, resuspend the bacterial pellet in five milliliters of ice-cold calcium chloride magnesium chloride solution and swirl carefully until the pellet has dissolved completely. Then, add another 25 milliliters of the solution to the dissolved bacterial pellet. Resuspend the other bacterial pellet as previously demonstrated. After this, repeat the centrifugation, and remove the supernatants.

If the competent cells are going to be directly transformed, resuspend each bacterial pellet in two milliliters of an ice-cold 0.1 molar calcium chloride solution by swirling the tubes carefully. To begin the transformation procedure, transfer 50 microliters of competent cells to two labeled 1.5 milliliter polypropylene tubes. Then, add one microliter of pUC19 plasmid DNA to one of the tubes. Mix gently, avoiding bubble formation, and incubate both tubes for 30 minutes on ice. After incubation, transfer the tubes to a heat block and incubate at 42 degrees Celsius for 45 seconds. Immediately transfer the tubes to ice, and incubate for two minutes. Now, add 950 microliters of SOC media to each tube and incubate them for one hour at 37 degrees Celsius to allow the bacteria to recover, and express the antibiotic resistant marker encoded in the plasmid.

To make a 1 to 100 dilution, add 990 microliters of SOC media and 10 microliters of cell suspension to a 1.5 milliliter tube. Then, make a 1 to 10 dilution by adding 900 microliters of SOC media and 100 microliters of cell suspension to a 1.5 milliliter tube. Next, plate 100 microliters of the diluted cell suspensions and 100 microliters of the negative control, onto separate selective plates containing ampicillin using a spreader and incubate the plates at 37 degrees Celsius for 12 to 16 hours. After incubation, count the colony-forming units, or CFUs, per plate, obtained through transformation, and record these data. To verify that the transformants have the pUC19 plasmid, pick a single, well-isolated colony from a plate with a sterile loop, and introduce it to a tube containing 3 milliliters of LB broth. Then, incubate the culture at 37 degrees Celsius with shaking, overnight. The next day, use a DNA mini prep kit to isolate DNA from 3 milliliters of the culture, according to the manufacturer’s instructions. After completing the DNA mini prep, digest the 1 microgram of purified pUC19 with a restriction enzyme at 37 degrees Celsius for 1 hour. Now, load 20 microliters of a molecular weight ladder, 1 microgram of digested plasmid DNA, and 1 microgram of undigested plasmid DNA into consecutive wells of a 1% agarose gel containing 1 microgram per milliliter ethidium bromide. Then, run the gel for 1 hour at 95 volts. Finally, visualize the gel with a UV illuminator.

In this experiment, E. coli DH5 Alpha chemically competent cells were prepared using an adaptation of the calcium chloride procedure, and then transformed with the plasmid pUC19 to determine transformation efficiency. To calculate the transformation efficiency, use the recorded CFU counts for the 1 in 100 and 1 in 10 dilutions, and any other dilutions with CFU counts between 30 and 300. First, the recorded CFU count, 246 in this example, is divided by the amount of DNA, .0001 micrograms here, that was plated. Then, this number is divided by the dilution factor used to give the transformation efficiency in CFUs per microgram. In this example, a 1 to 10 dilution was used and 100 microliters of a 1 milliliter solution was plated, giving a final dilution factor of 0.01. In the undigested plasmid lane, the circular DNA may appear as two or three different bands of varying brightness. This is because the circular, uncut DNA may exist in several different conformation states, such as supercoiled, open circle, or more linear, and each of these move through the gel at different rates. Analysis of the recovered plasmid DNA digestion indicated that the plasmid used has an expected size of pUC19 DNA, 2,686 base pairs.

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