Neurocircuit Assays für Anfällen bei Epilepsie Mutanten Drosophila

Zu Beginn dieses Neurocircuit-Assays werden Fliegen auf Zahnwachs montiert. Auf einem Objektträger werden vier Elektroden in die Fliege eingeführt. Eine Masseelektrode im Bauchraum, eine Aufzeichnungselektrode im dorsalen Längsflug, Muskeln im Thorax und zwei Stimulationselektroden im Kopf.

Die Elektrodenplatzierung wird bestätigt, indem die Schwelle für die Riesenfaser gefunden und eine sichtbare Reaktion festgestellt wird. Der Fliege wird ein hochfrequenter Wellenzug mit der gewünschten Spannung zugeführt, und wenn kein Festfressen auftritt, ist die Spur auf dem Oszilloskop flach. Wenn es zu einem Anfall kommt, zeigt die Spur als Reaktion auf den hochfrequenten Reiz eine unkontrollierte Aktivität.

Hallo, ich bin Mark Toay, Professor am Department of Environmental Science Policy and Management an der University of California Berkeley. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Bestimmung elektrophysiologischer Anfälle bei Drosophila. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Anfälle in Drosophila-Mutanten zu untersuchen und Anfallsschwellen für diese Mutanten zu bestimmen.

Also lasst uns loslegen. In der Nacht vor dem Experiment werden männliche Fliegen des gewünschten Genotyps mit Kohlendioxid betäubt und in ein Fläschchen mit frischem Futter gelegt, das mit einem weichen Nylonplug oder Wattebausch verschlossen ist. Nach der Kohlendioxid-Anästhesie wird die Anfallsschwelle verändert, so dass die Fliegen am besten mindestens sechs Stunden lang stehen bleiben, obwohl eine Nacht ideal ist.

Am Tag des Experiments werden die Fliegen nacheinander mit einer Schicht Zahnwachs auf einer Seite auf Objektträger montiert. Die Fliegen werden ohne Betäubung manipuliert, indem sie mit einer abgestumpften 23-Gauge-Nadel, die an einer Vakuumleitung befestigt ist, vom Kopf aufgenommen werden. Sie werden dann an den Objektträgern befestigt, indem die Beine und Flügel nach unten in das Zahnwachs gedrückt werden.

Sobald die Fliege immobilisiert ist, wird Wachs um den Hals und die Augen nach oben geschoben, um den Kopf vollständig zu immobilisieren. Die Fliege ist nun montiert und bereit für die Elektrophysiologie. Der elektrophysiologische Aufbau besteht aus drei Sätzen von Mikromanipulatoren, an denen jeweils ein bis zwei geschärfte Wolframelektroden angebracht sind.

Die Wolframelektroden werden blank verwendet und benötigen keine Kochsalzlösung. Die Spannung wird durch einen Stimulator bereitgestellt, der mit einer Isolationseinheit verbunden ist, die an den Stimulationselektroden befestigt ist. Die Aufnahmeelektrode ist mit einem Vorverstärker verbunden, der wiederum an einem digitalen Speicheroszilloskop befestigt ist.

Es ist zwar nicht unbedingt erforderlich, aber es ist sinnvoll, einen Lautsprecher an das Oszilloskop anzuschließen, damit die Antworten hörbar gemacht werden können. Die immobilisierte Fliege wird nun auf den Mikroskoptisch gelegt und eine Masseelektrode in den Bauch der Fliege eingeführt. Die Aufzeichnungselektrode wird in einen der dorsalen Längsmuskeln im Thorax der Fliege eingeführt.

Die geschärften Elektroden sind stark genug, um das Exoskelett zu durchstechen. Wenn gelegentlich Vorsicht geboten wird, verbiegen sich die Elektroden und müssen ausgetauscht werden. Die Stimulationselektroden werden durch die Kutikula des Kopfes in den Raum zwischen Auge und Antenne eingeführt.

Der Flyer ist nun für die Aufnahme eingerichtet. Bereiten Sie als Nächstes die Instrumente für die Aufnahme vor. Der Stimulator sollte die folgenden Einstellungen haben: ein kontinuierliches Pulsintervall von zwei Sekunden zwischen jedem Puls, keine Pulsverzögerung und eine Pulsbreite von nicht mehr als 0,2 Millisekunden.

Das Oszilloskop sollte die Speicherfunktion aktiviert haben und über die folgenden Einstellungen verfügen. Die Zeit pro Division sollte auf eine Millisekunde pro Division festgelegt werden. Die Tresore pro Division sollten später auf 100 Millivolt pro Division eingestellt werden.

Wenn das Ansprechverhalten nicht ideal stark ist, kann diese Einstellung auf 50 Millivolt pro Teilung geändert werden. Die Riesenfaserschwelle wird bestimmt, indem einzelne elektrische Impulse mit inkrementeller Spannung abgegeben und die minimale Spannung notiert wird, die erforderlich ist, um unsere Reaktion in der Aufzeichnungselektrode zu registrieren. Diese Messung liegt in der Regel bei etwa zwei Volt.

Sobald der Schwellenwert für Riesenfasern bestimmt wurde, hören Sie auf, die Fliege zu pulsieren, und ändern Sie die Einstellungen am Oslo-Zielfernrohr auf 0,2 Sekunden pro Division. Ändern Sie nun die Einstellungen am Stimulator. Stellen Sie das Pulsintervall auf einen einzelnen Puls ein und aktivieren Sie die Pulsfolge.

Die Wellenformparameter sind auf 0,5 Millisekunden bei 200 Hertz eingestellt. Für 300 Millisekunden wird die Spannung auf die gewünschte Einstellung geändert und ein hochfrequenter Wellenzug von Impulsen an das Gehirn der Fliege abgegeben, um einen Anfall auszulösen. Nach der Impulsfolge zeigt die Oszilloskop-Spur eine flache Komponente. Wenn in diesem Fall kein Anfall induziert wird, wenn die Einstellungen schnell auf die Einstellungen zurückgesetzt werden, die zu Beginn der Aufzeichnung vorgenommen wurden, verursachen die einzelnen Impulse eine Reaktion im Riesenfasersystem.

Wenn ein Anfall ausgelöst wird, zeigt das Oszilloskop die anfallsähnliche Aktivität nach dem Zug an. Wenn die Einstellungen nun schnell auf die ursprünglichen Einstellungen zurückgesetzt werden, können die einzelnen Impulse keine Reaktion auslösen. Im Riesenfasersystem.

Die Fliegen haben nach einem hochfrequenten Reizwellenzug eine Refraktärperiode, in der keine anfallsähnliche Aktivität induziert werden kann. Tritt kein Anfall auf, sind die Fliegen etwa sieben Minuten lang refraktär. Und wenn ein Anfall ausgelöst wird, sind die Fliegen nach der Refraktärzeit etwa 17 Minuten lang refraktär

Zusätzliche hochfrequente Reize können an dieselbe Fliege mit Spannungen abgegeben werden, die entweder höher oder niedriger als der vorherige Zug sind, bis die Anfallsschwelle bestimmt ist oder bis die Reaktion der Riesenfaser zu schwach wird, um sie zu sehen, in welchem Fall die Fliege verworfen und ein neues Experiment gestartet werden muss. Nach Abschluss des Experiments wird die Fliege aus dem elektrophysiologischen Aufbau entfernt, aus dem Wachs gelöst und unsachgemäß montierte Fliegen mit korrekter Elektrodenplatzierung entsorgt. Eine hochfrequente Stimulation bei einer gewählten Spannung kann zu anfallsähnlichen Aktivitäten führen, bei denen kein Anfall auftritt.

Die Spur unmittelbar nach der Stimulation ist flach. Wenn es zu einem Anfall kommt, zeigt die Ablaufverfolgung unkontrollierte Aktivität an. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie mit Hilfe der Elektrophysiologie auf Krampfanfälle und Drosophila untersuchen können.

Bei der Verwendung dieses Assays ist es wichtig, dass die Fliege richtig montiert ist, damit die Elektroden leicht eingeführt werden können. Unsachgemäß platziert. Elektroden sind die schwierigste Ursache für Probleme bei diesem Assay.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.