Primäre Kultur der erwachsenen Ratte Herz Myozyten

In diesem Papier haben wir beschrieben, eine typische Art und Weise zu isolieren und Kultur erwachsenen Ratte Herz Myozyten. Collagenase und Protease werden verwendet, um zu verdauen und zu isolieren einzelnen Myozyten. Myozyten kultivierten folgen Sie diesem Protokoll erfüllen die meisten Anforderungen Experiment.

Der Eingriff beginnt mit dem Herausschneiden des Herzens einer erwachsenen Ratte und dem Aufhängen an das Perfusionssystem. Enzymlösungen werden etwa 30 Minuten lang perfundiert, danach wird das Herz entfernt. Die zerkleinerte und enzymatische Verdauung wird in einem kleinen Becherglas fortgesetzt

Am Ende der Verdauung werden die Zellen durch mechanisches Rühren in eine Einzelzellsuspension dissoziiert und in ein steriles Röhrchen filtriert. Primäre Herzzellen werden dreimal in Puffern mit steigender Kalziumkonzentration gewaschen, in Kulturmedium resuspendiert und auf laminatbeschichteten Gewebekulturschalen plattiert. Hallo, ich bin Shahi aus dem Labor von Henry Cowa in der Abteilung für Physiologie und Zellularphysik an der Columbia University.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung anderer Herzzellen von Ratten. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Kalziumkanäle im Herzen zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Vergewissern Sie sich am Tag vor der Rattenoperation, dass alle Lösungen hergestellt sind, aber fügen Sie noch keine Enzyme hinzu. Die Puffer A, B und der Waschpuffer sollten vor der Lagerung bei vier Grad Celsius auf Sterilität gefiltert werden. Sechs Well-Gewebekulturplatten müssen ebenfalls am Vortag mit Laminatlösung überzogen und bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Inkubator gelagert werden.

Am Tag der Operation. Bereiten Sie die chirurgischen Instrumente vor, indem Sie die Klemmschere und die Pinzette mit 70%igem Ethanol desinfizieren und auf einem Papiertuch trocknen lassen. Eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einem halben Milliliter Heparinlösung gefüllt ist, wird bereitgelegt.

Jetzt ist es eine gute Praxis, das Perfusionsgerät, das mit 70%igem Ethanol betrieben wird, mit der Peristaltikpumpe in umgekehrter Richtung zu waschen. Wenn Sie fertig sind, spülen Sie das Gerät mit Ethanol, spülen Sie es mit doppelt destilliertem Wasser und spülen Sie es schließlich mit Puffer A. Der Durchfluss wird in einem Becherglas gesammelt und in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad gestellt. Zur Vorbereitung des gereinigten Profusionsapparats füllen Sie das rechte Spritzenröhrchen mit 40 Millilitern Puffer A und das linke Spritzenröhrchen mit 40 Millilitern Puffer B. Grundieren Sie den Perfusionsschlauch bis zur Spitze des Katheters, indem Sie Puffer A durch das Gerät fließen lassen.

Füllen Sie den Puffer mit einer Spritze bis zu 40 Milliliter auf. Stellen Sie sicher, dass nach diesem Schritt keine Luftblasen in den Schläuchen eingeschlossen sind, schließen Sie nun den Puffer, eine Spritze mit dem Absperrhahnventil und wiederholen Sie den Vorgang so, dass der Profusionsschlauch nun mit Puffer B grundiert ist. Der Profusionsschlauch ist endlich fertig und wird mit dem Puffer belassen. B Absperrhahnventil geöffnet, aber der Durchfluss wird gestoppt.

Entsorgen Sie mit dem Regler an der Infusionsleitung den Pufferdurchfluss im Auffangbecher. Das Letzte, was Sie vor der Operation tun müssen, ist, die erforderlichen Enzyme zu Ihrer Stammlösung hinzuzufügen und dann die Enzymlösung so zu filtrieren, wie die anderen Lösungen am Vortag gefiltert wurden. Nach dem Filtrieren kann diese Lösung nach dem Standardprotokoll bei Raumtemperatur belassen werden.

Die Ratte mit Isofluor in einer Gaskammer einschläfern. Desinfizieren Sie den Inzisionsbereich am Brustkorb mit 70 % Ethanol. Öffne die Truhe mit einer Schere und lege das Herz frei.

Injizieren Sie den linken Ventrikel mit 0,5 Millilitern Heparinlösung. Entferne das Herz mit einem großen Teil der Aorta. Führen Sie den Katheter sofort in die Aorta ein.

Ein typisches Rattenherz sollte einen hohen Anteil an gesunden, stäbchenförmigen Myozyten und wenige abgestorbene, abgerundete Zellen aufweisen. Wenn das folgende Verfahren ordnungsgemäß eingehalten wird, klemmen Sie die Aorta zunächst an den Katheter. Die Spitze des Katheters sollte nicht zu weit in das Herz hineingeschoben werden, um eine gute Durchblutung des Herzens durch die Herzkranzgefäße zu gewährleisten.

Sobald sie festgeklemmt ist, binden Sie die Aorta mit der Naht an den Katheter. Öffnen Sie als Nächstes den Regler der IV-Leitung, um eine schnelle Tropfrate zu ermöglichen, und lassen Sie Buffer Bee das Herz während der Pufferbienenwäsche auswaschen. Verwenden Sie die kleine Schere und Pinzette, um die Vorhöfe und jegliches Fett- oder Lungengewebe, das am Herzen haftet, zu entfernen.

Nachdem Puffer B abgeschlossen ist, schalten Sie den Fluss eine Weile auf Puffer um. Puffer A wird fünf Minuten lang fließen gelassen. Erwärmen Sie die Enzymlösung in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.

Wenn Puffer A aus der Spritze erschöpft ist, aber noch im Schlauch vorhanden ist, laden 50 Milliliter der Enzymlösung in Spritze A der Profusionsvorrichtung. Es ist nun notwendig, den gesamten Durchfluss aus dem Auffangbecher im Wasserbad zu entsorgen, bis die Enzymlösung das Herz durchdringt. Sobald die Enzymlösung das Herz durchdrungen hat, aktivieren Sie die Peristaltikpumpe, die so eingerichtet ist, dass sie die Enzymlösung aus dem Auffangbecherglas in die nachgefüllte Spritze überführt.

Lassen Sie die Enzymlösung 10 Minuten lang durch das Herz fließen. Während das Herz verdaut, beginnt es aufgebläht auszusehen, wenn 37,5 Mikroliter 0,1 molares Calciumchlorid auf die Enzymlösung in Spritze A gegeben werden, um eine effektive Konzentration von 0,1 millimolares Calcium zu erhalten. Dies ist die erste von mehreren Calciumchlorid-Zusätzen, die verwendet werden, um die Konzentration nach 10 Minuten zu erhöhen, die Konzentration von Calcium auf 0,2 Millimolar zu erhöhen, indem weitere 50 Mikroliter 0,1 molare Calciumchlorid zu Spritze A hinzugefügt werden, und lassen Sie die Fülle weitere 10 Minuten lang einwirken.

Nach Ablauf von 10 Minuten werden die Ventrikel abgeschnitten und das Herz in ein kleines steriles Becherglas mit 20 Millilitern Enzymlösung in das Becherglas gegeben. Erhöhen Sie die Kalziumkonzentration auf 0,4 Millimolar, indem Sie weitere 40 Mikroliter 0,1 molares Kalziumchlorid hinzufügen und das Herz mit einer kleinen sterilen Schere vorsichtig in 10 oder mehr Stücke zerkleinern. Inkubieren Sie nun das Becherglas bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schaukeln.

Nach fünf Minuten Inkubation fügen Sie 40 Mikroliter 0,1 molares Calciumchlorid hinzu, um eine effektive Konzentration von 0,6 millimolares Calcium zu erhalten, und iterieren Sie die Herzstücke vorsichtig drei- bis fünfmal, nachdem Sie weitere fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, fügen Sie 40 Mikroliter 0,1 molare Calciumchlorid hinzu und iterieren Sie vorsichtig wie zuvor. Verwenden Sie einen sterilen 500-Mikrometer-Filter, um die verdauten Einzelmyozyten vom unverdauten Bindegewebe zu trennen. Lassen Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem 50-Milliliter-Röhrchen absetzen, ruckartig entsorgen Sie den Überstand mit einem Transfer-VI. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig im Waschpuffer Nummer eins und lassen Sie die Zellen 10 bis 20 Minuten lang bei Raumtemperatur absetzen, während sich die Zellen absetzen.

Nehmen Sie ein kleines Aliquot und nutzen Sie diese Zeit, um die Qualität und Lebensfähigkeit der Zellen in Suspension unter einem inversen Mikroskop zu beurteilen. Ein gutes Präparat hat einen hohen Anteil an stäbchenartigen Zellen mit scharfen Streifen. Sobald sich die Zellen abgesetzt haben, entsorgen Sie die Schlinge und suspendieren Sie die Zellen vorsichtig wieder in Waschpuffer.

Nummer zwei, lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur absetzen, was wiederum 10 bis 20 Minuten dauern sollte, und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 5%-Serummedien, bevor Sie die Zellen auf Gewebekulturplatten übertragen. Waschen Sie die Teller mit einem XSFM.

Übertragen Sie die Zellen in einer gewünschten Dichte und inkubieren Sie in einem CO2-Gewebekultur-Inkubator. Schalten Sie das Medium für drei bis fünf Stunden auf ein XSFM-Zellen können bis zu vier Tage kultiviert und bei Bedarf für Experimente verwendet werden. Es sollten mehr als 70 % lebende Herzmyozyten unter dem inversen Mikroskop vorhanden sein, wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wurde.

Dabei handelt es sich um isolierte Myozyten, die nach 48-stündiger Kultivierung mit YFP REM transfiziert wurden. Zellen dieser Qualität werden in der Regel nach diesem Verfahren kultiviert. Wir zeigen Ihnen nur, wie man isoliert und die Kultur sind so heiße Zellen.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, so schnell und sauber wie möglich zu sein. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.