Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, angereicherte Populationen von Skelettmuskelstammzellen aus mikropräparierten Gewebeimplantaten zu isolieren, die aus adulten Muskeln oder Embryonen gewonnen wurden, um deren Verhalten und Funktion zu untersuchen. Diese Zellen können auch einen therapeutischen Nutzen haben. Dazu werden zunächst Zielmuskeln aus adulten Mauskadavern oder Embryonen aus Gebärmuttergewebe unter aseptischen Bedingungen präpariert.

Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Muskelgewebe für erwachsenes Muskelgewebe zu waschen und zu reinigen, Fett und Bindegewebe zu präparieren und in frisches DF 20-Medium für Embryonen zu überführen. Entfernen Sie die äußeren Membranen und inneren Organe und geben Sie es in frisches DF 20. Medium, dann präparieren, um muskelreiche Regionen zu isolieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, isoliertes Gewebe in 400-Mikrometer-Würfel zu mikrodisezieren. Übertragen Sie z.B. einzeln in die Mitte 60 Vertiefungen einer 96-Well-Platte und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen zu bewerten.

Die Zellen beginnen zwischen einigen Stunden und bis zu zwei Wochen aus erfolgreichen x Explantaten zu schlüpfen, postex explan, je nach Herkunft des Gewebes. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass Zellen, die beginnen, aus erfolgreichen X-Explan-Zellen hervorzugehen, expandiert und anschließend für eine Reihe verschiedener In-vitro- und In-vivo-Zwecke verwendet werden können, einschließlich Proliferation und Apoptose, Studien und Identifizierung von Proteinmarkern. Diese Zellen können auch klonal gewonnen, genetisch verändert und schließlich in einen Wirt transplantiert werden, um die Regeneration zu untersuchen oder therapeutische Anwendungen zu testen.

Hallo, ich bin Janet Smith von meinem Labor für Skelettmuskelstammzellbiologie an der School of Biosciences der Universität Birmingham. Ich bin Dean Lana aus dem Labor von Janet Smith und ich bin Byron Chen, ebenfalls aus dem Labor von Janet Smith. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Gewinnung von Stammzellkulturen der Skelettmuskulatur aus Microdisect X-Fetten, die aus erwachsenen Muskeln und Embryonen gewonnen wurden.

Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um das Verhalten von Skelettmuskelstammzellen wie Proliferation, Apoptose und Differenzierung zu untersuchen, sowie die Funktion von abberanten Muskelstammzellen bei Krankheiten wie Muskeldystrophie. Also lasst uns loslegen. Die grundlegende Methode zur Gewinnung von Mikro-Explantatkulturen aus der Skelettmuskulatur beginnt mit der Dissektion der Zielmuskeln einer frisch kalten Maus unter aseptischen Bedingungen.

Bei dieser Demonstration werden die Muskeln der hinteren Gliedmaßen präpariert, isolierte Muskeln durch zwei Wechsel von DF 20 Medium gewaschen und dann in frisches DF 20 Medium in einer 60-Millimeter-Schale gelegt. Mit einem Stereo-Dissektionsmikroskop werden die Muskeln unter sterilen Bedingungen vorsichtig mikrodiseziert, um Fett, Bindegewebe und Knochen auszuschließen. Schneiden Sie anschließend die gereinigten Muskelstücke mit einer Juwelierzange in 400-Mikrometer-Würfel.

Platzieren Sie die Muskelstücke einzeln in die mittleren 60 Vertiefungen einer 96-Well-Platte, die 50 Mikroliter DF 20 pro Stück enthält. Füllen Sie die Alta-Vertiefungen gut mit Kochsalzlösung, um ein Austrocknen der Vertiefungen mit Explan zu verhindern. Überprüfen Sie die Vertiefungen unter dem Mikroskop und legen Sie dann die 96-Well-Platte in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.

Das An- und Auswachsen von Micro-Explan wird nach 24 bis 48 Stunden Inkubation und danach in Intervallen von 48 bis 72 Stunden bewertet, abhängig von der Wachstumsrate der zu kultivierenden Muskeln. Hier sind Beispiele für das Wachstum am zweiten Tag aus ex-explantierten adulten Skelettmuskeln und ein etabliertes Ex-Explantat-Wachstum mit aggregierten Kulturen und hoher Zelldichte gezeigt. Die X-Explantation wurde entsprechend dem Grad der Konfluenz der Zellen in jeder einzelnen Vertiefung bewertet, was später für die Expansion und Isolierung von SMS-Zellen demonstriert wird.

Die Outgrowth-Kultur sollte einzeln auf Zellen mit einer überwiegend SMS-Zellmorphologie überwacht werden, d.h. sphärische mononukleäre Zellen mit hoher Refraktion, die in aggregierenden Clustern wachsen. Beginnen Sie diesen Eingriff mit der Präparierung von E 12,5-Embryonen aus der Gebärmutter. Auch Embryonen im Stadium E 11,5 bis E 17,5 können auf diese Weise präpariert werden.

Legen Sie die Embryonen einzeln in Petrischalen mit PECM, um sie für eine detaillierte Mikrodissektion vorzubereiten. Einzelne Embryonen werden dann weiter präpariert, um Bereiche zu isolieren, die reich an Skelettmuskeln sind. Entfernen Sie zunächst die inneren Organe, präparieren Sie die Schwanz-, Hinter- und Fallgliedmaßen sowie die oberen und unteren Körperwände.

Legen Sie das präparierte Gewebe in frisches PECM, um den Embryo zu entnehmen. Mikro-Explankulturen mikrodisezieren die präparierten vier Gliedmaßen, die Hintergliedmaßen sowie die oberen und unteren Körperwände, um kleine Würfel aus Gewebe gleicher Größe herzustellen. Platzieren Sie diese Mikropflanzen einzeln in den mittleren 60 Vertiefungen einer 96-Well-Platte, die 50 Mikroliter PECM pro Vertiefung enthält.

Pro Embryo, der für die Kultivierung von Embryonen untersucht wurde, sollten mindestens 60 Vertiefungen mit einer x Pflanze pro Vertiefung angelegt werden. Die mittleren 60 Vertiefungen können in Regionen unterteilt werden, die angeben, von wo aus der Plan abgeleitet wurde. Dieses Design ermöglicht 15 Vertiefungen, die jeweils die Gliedmaßen, die obere Körperwand, die hintere Gliedmaße und die untere Körperwand enthalten.

Explan inkubieren den Explan drei Wochen lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Während der dreiwöchigen Inkubation werden die Explane am dritten, siebten, 14. und 21. Tag der Kultivierung mit einem inversen Mikroskop bewertet. Explan werden entsprechend dem Grad der Konfluenz der Zellen in jedem Individuum bewertet. Brunnen.

Dieses Beispiel veranschaulicht die verschiedenen Konfluenzgrade von E 15.5 primären embryonalen Explankulturen, die mit dem Mythos fünf gefärbt wurden: null bis 14 %15 bis 24 %25 bis 49 %50 bis 74 % und 75 bis 100 %fotografische Bilder von Kulturen können auch aufgenommen werden, sobald COFLUENT X Explan-Kulturen, die die morphologischen Merkmale von SMS-Zellen aufweisen, Subkulturen sein können. Nehmen Sie das Kulturmedium aus den ausgewählten Vertiefungen und filtern Sie es mit einer 0,2-Mikrometer-ACR-Scheibe. R Spritzenfilter.

Behalten Sie das Medium für die Verwendung bei, ist das konditionierte Medium für jeden. Nun, fügen Sie 100 Mikroliter Scheiben hinzu, verdünnt von eins bis 10 in PECM. Stellen Sie die Platte dann für 20 Minuten wieder in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Verwenden Sie nach 20 Minuten eine Pipettenspitze, um die gelösten Zellen vorsichtig von der Oberfläche der Vertiefung zu kratzen, und zentrifugieren Sie anschließend die Zellsuspension drei Minuten lang bei 1000-facher Schwerkraft, um die Zellen zu pelletieren. Die Zellen werden durch Reanimation verdünnt, in zwei Millilitern PECM suspendiert und dann in die Vertiefungen einer frischen 48-Well-Platte überführt. Übertragen Sie schließlich die Zellmischung zur weiteren Expansion auf 48-Well-Platten.

Zur Vorbereitung der Zellen für die Analyse zeigen die Platten Subkulturen, primäre embryonale Splunk-Kulturen in PECM und konditioniertes Medium auf Deckgläsern in 48. Die Zellen der Well-Platten werden mit einer Dichte von dreimal 10 bis zum Quadratkubator der drei Zellen bei 37 Grad Celsius plattiert, damit sich die Zellen anheften können, was normalerweise vier bis sechs Stunden für die Beurteilung der Apoptose und Proliferation dauert. Waschen Sie die Zellen auf den Eindeckeinlagen zweimal in PBS und fixieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4%para Formaldehyd, waschen Sie die Eindeckeinlagen 10 Minuten lang mit PBS und färben Sie sie dann drei Minuten lang mit 10 Mikrogramm pro Milliliter DPI.

Wickeln Sie den Teller einmal für fünf bis 10 Minuten in PBS mit Folie ein. Entfernen Sie danach den Deckglas aus der Vertiefung und drehen Sie ihn auf eine Stelle von daco cyto nation. Montagemedium auf einem Glasobjektträger die Ränder des Deckglases zur Aufbewahrung mit Nagellack versiegeln.

Wickeln Sie die Objektträger in Folie ein und legen Sie sie zum Zählen bei minus 20 Grad Celsius hin. Die Objektträger werden unter Fluoreszenz an einem aufrechten Mikroskop betrachtet und mit einem IP-Grae auf apoptotische und mitotische Zellen untersucht. Wenn Explan sorgfältig aus adulten Skelettmuskeln oder aus Embryonen implantiert werden, beginnen sie innerhalb weniger Stunden bis 72 Stunden nach der Inkubation bei 37 Grad Celsius Zellen zu bilden.

Abhängig von ihrer Quelle erfolgt die Expansion der Zellpopulation über einen Zeitraum von Tagen für Embryoimplantate oder Wochen für ältere Skelettmuskelimplantate zur Erzeugung von hochdichten aggregierten SMS-Zell-Primärkulturen. Hier werden repräsentative Ergebnisse einer erfolgreichen klonalen Derivation einer SMS-Zelle gezeigt. Eine einzelne Zelle, die in eine 96-Well-Platte isoliert wird, wird zu einer Kolonie einzelligen Ursprungs, die schließlich zu einer etablierten klonalen Population führt. Die Immunhistochemie MIF fünf wird anschließend verwendet, um die Identität der SMS-Zellen zu überprüfen.

Aus Skelettmuskeln gewonnene adulte Stammzellen werden in den vorderen Tibialis-Muskel von Wirtsmäusen transplantiert und diese Zellen werden durch Beta-GC-Markierung identifiziert. In diesem Bild, das drei Monate nach der Injektion aufgenommen wurde, werden drei kürzlich fusionierte Beta-Galacto-positive Zellen, die blau gefärbt wurden, 14 Monate nach der Injektion in einer Muskelfaser beobachtet, und ein umfangreicher Beitrag von btic galacto-positiven Zellen in Muskelfasern wird durch braun gefärbte Anti-Beta-Galacto-Antikörper nachgewiesen. Eine Beta-Galacto-positive Satellitenzelle ist durch den Pfeil in diesem Bild zu erkennen. In der Kontrolle, bei der kein primärer Antikörper verwendet wurde, wenn er 12 Monate nach der Injektion aus injizierten Wirtsmuskeln isoliert wurde, fehlt eine Färbung.

Die Karyotypisierung einer klonalen SMS-Zelllinie einer Maus zeigt eine normale diploide Chromosomenkomplement-Beta-Galacto-Expression in einer Kolonie von PD-Fünf-Null-A-Zellen wird durch histochemische In-vitro-Analysen von dystrophischen embryonalen Mythos gezeigt. Fünf positive Myoblasten zeigen, dass diese Myoblasten hyperproliferativ und anfällig für Apoptose sind, wie in dieser Grafik gezeigt. Die Auswuchsrate von embryonalen Myoblasten aus der Muscle X Explan-Kultur ist sowohl in MDX- als auch in CAV-3-Knockout-Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-X-Explan erhöht. Ein Beispiel für ein mit MIF fünf immungefärbten Explan ist hier dargestellt. Eine Hyperproliferation embryonaler Myoblasten wird in diesen MDX- und CAV-Drei-Knockout-Mutanten beobachtet, die durch KI 67-positive Immunreaktivität bestimmt wurde.

Darüber hinaus tritt in beiden Mutanten eine erhöhte Apoptose auf, wie die DPI-Färbung zeigt, und dieses Bild zeigt ein Beispiel für eine apoptotische Zelle, die durch den Pfeil angedeutet ist. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Skelettmuskelstammzellen aus Erwachsenen und Embryonen isolieren können. Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, ist es wichtig, daran zu denken, auf die Größe Ihrer mikropräparierten Explantate zu achten.

Wenn sie zu groß sind, krähen sie und die Zellen sterben ab. Wenn sie zu klein sind, werden sie nicht unterstützen. Gutes Umsatzwachstum.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.