Zinkfinger-Nuklease-basierte Genomeditierung: Eine Technik zur Modifikation des Genoms in menschlichen pluripotenten Stammzellen durch doppelsträngigen homologieabhängigen Reparaturmechanismus

Die Zinkfingernuklease oder ZFN enthält eine Zinkionen-stabilisierte, DNA-bindende Makrodomäne, die über einen Linker mit einer Endonuklease-Domäne verbunden ist. Diese Struktur trägt dazu bei, die Spezifität zu erhalten, während die DNA geschnitten wird.

Um ZFNs für die Genomeditierung zu verwenden, nehmen Sie eine Kultur mit menschlichen pluripotenten Stammzellen. Ergänzen Sie es mit einem Plasmid, das für ZFN kodiert. Fügen Sie ein Reparaturplasmid hinzu, das das Zielgen und das Antibiotikaresistenzgen enthält, das zwischen Homologiearmen oder HAs eingebettet ist. Elektropopolieren Sie das Zell-DNA-Gemisch, wobei der elektrische Strom den Eintritt von Plasmiden in die Zelle erleichtert.

Sobald sie sich im Inneren befinden, binden die Zinkfingermotive von translatiertem ZFN an die Tripletts komplementärer Basenpaare im Wirtsgenom und positionieren die Fok-1-Restriktionsendonuklease korrekt an der Zielstelle. ZFNs binden paarweise an gegenüberliegende Stränge, wodurch die Fok-1-Homodimerisierung ein aktives katalytisches Zentrum bilden kann, in dem Fok-1 DNA-Doppelstrangbrüche oder DSBs erzeugt, die einen Vier-Nukleotid-Überhang erzeugen.

Das Vorhandensein von HAs im Reparaturplasmid steuert die homologieabhängige Reparatur, bei der das überhängende Ende invertiert und die homologe HA-Sequenz als Vorlage verwendet. Die DNA-Synthese setzt sich fort, indem Nukleotide hinzugefügt werden, die zum Zielgen komplementär sind.

Die entstehenden Lücken werden ligiert, was die Geninsertion erleichtert. Zusätzlich wird das promotorlose Antibiotikaresistenzgen von einem Wirtspromotor stromaufwärts der Insertionsstelle exprimiert. Erfolgreich editierte Zellen wachsen im Antibiotika-Auswahlmedium.