TALEN-vermittelte gezielte Genintegration: Verwendung von sequenzspezifischen Nukleasen für die präzise Insertion von fluoreszierenden Proteingen in hiPSCs

Beginnen Sie mit der humanen induzierten pluripotenten Stammzell- oder hiPSC-Suspension in Medien. Fügen Sie ein Paar Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornuklease oder TALEN-kodierende Plasmide hinzu. Ergänzen Sie mit einem Donorplasmid, das ein fluoreszierendes Proteingen trägt, gekoppelt an ein Antibiotikaresistenzgen, mit angrenzenden Homologiearmen für die spezifische Ausrichtung auf Zielloci.

Elektropopolieren Sie das Gemisch, um transiente Poren in den Zellmembranen zu erzeugen, die die Plasmidinternalisierung ermöglichen. Sobald sie sich in den Zellen befinden, werden die TALEN-kodierenden Plasmide verarbeitet und produzieren TALENs - chimäre Proteine, die aus einer ortsspezifischen TALE-DNA-Bindungsdomäne bestehen, die mit einer unspezifischen FokI-Restriktions-Endonuklease-Spaltdomäne fusioniert ist.

Jedes TALEN-Monomer erkennt und bindet über seine DNA-Bindungsdomäne - bestehend aus Tandem-Aminosäure-Repeat-Modulen - Ziel-Loci, ein Modul pro Nukleotid, auf jedem DNA-Strang in entgegengesetzten Orientierungen, getrennt durch eine Spacer-Sequenz. FokI-Domänen dimerisieren und spalten dann DNA innerhalb der Spacersequenz, wodurch Doppelstrangbrüche mit Überhängen entstehen.

In Gegenwart von Spenderplasmiden, die Homologiearme enthalten, die zu Regionen komplementär sind, die die gespaltene Stelle flankieren, erfolgt eine homologiegerichtete Reparatur unter Verwendung der homologen Sequenz als Matrize für die DNA-Reparatursynthese, um die Doppelstrangbrüche zu überbrücken. Nach der Ligation der Kerben werden das dazwischenliegende fluoreszierende Protein und die Antibiotikaresistenzgene in das Wirtsgenom integriert.

Behandeln Sie die hiPSCs, die zur Unterstützung des Wachstums auf einer Feeder-Zellschicht ausgesät werden, mit antibiotikahaltigen Medien. Das promotorlose Antibiotikaresistenzgen - angetrieben von einem stromaufwärts gelegenen endogenen Promotor - erleichtert die Selektion von TALEN-editierten Zellen.