phiC31-Integrase-vermittelte ortsgerichtete Transgenintegration: Eine Mikroinjektionstechnik zur ortsspezifischen Transgenintegration in einen Anopheles-Vektor

phiC31-Integrase ist ein aus Phagen gewonnenes Rekombinase-Enzym, das die ortsspezifische Rekombination eines Transgens, eines fremden Gens, in ein Wirtsgenom katalysiert. Für die transgene Integration in einen Anopheles-Wirt beginnen Sie mit einem Anopheles-Embryo in einem geeigneten Puffer.

Das Anopheles-Genom ist mit einer Anheftungsstelle für die Genintegration und einem cyan-fluoreszierenden Marker für die visuelle Selektion vorgefertigt. Als nächstes fügen Sie ein kleines Volumen eines Donorplasmids mit der gewünschten Transgenfracht, einer Bindungsstelle, einem rot fluoreszierenden Marker und Plasmidrückgratkomponenten in ein Fläschchen hinzu. Fügen Sie dann ein optimales Volumen eines Helferplasmids hinzu, das eine genkodierende Integrase trägt. Laden Sie nun das Plasmidgemisch in eine Mikrospritze.

Injizieren Sie die Plasmide vorsichtig in den hinteren Pol des Embryos, den Ursprungsort der Keimzellen, was zu einer leichten Bewegung des Zytoplasmas führt. Im Inneren des Embryos beginnt das Helferplasmid mit der Synthese von Integrase-Enzymen.

Das Integrase-Enzym vermittelt die ortsspezifische Rekombination zwischen dem Spenderplasmid und dem Wirtsgenom. Somit integrieren sich das Transgen und der rot fluoreszierende Marker aus dem Donorplasmid in die rekombinanten Anheftungsstellen im Anopheles-Genom. Danach wird der injizierte Embryo unter physiologischen Bedingungen für das Schlüpfen mit intermittierendem Schwenken inkubiert.

Innerhalb weniger Tage schlüpft aus dem Embryo eine Larve. Unter einem Fluoreszenzmikroskop exprimiert die Anopheles-Larve mit erfolgreich integrierten Genen sowohl Cyan-Fluoreszenz, die das Wirtsgenom markiert, als auch rote Fluoreszenz, die das Transgen aus dem Donorplasmid markiert.