CRISPR-Interferenz-basiertes Gen-Silencing: Eine Technik zur gezielten Unterdrückung der Genfunktion in pathogenen Leptospiren

CRISPR-Interferenz oder CRISPRi verwendet eine deaktivierte Variante von Cas9, dCas9, für gezieltes Gen-Silencing, das die Genfunktion unterdrückt.

Um CRISPRi durchzuführen, verwenden Sie ein Shuttle-Vektor-Konstrukt - ein Plasmid, das Replikationsursprünge enthält, die sowohl E. coli- als auch Leptospira-Bakterien entsprechen, was die Vermehrung in beiden Spezies erleichtert.

Der Vektor enthält auch eine Sequenz, die spezifisch für das dCas9-Gen ist, und eine Single-Guide-RNA oder sgRNA, um die Zielsequenz zu erkennen.

Zunächst befindet sich der Shuttle-Vektor im Inneren des Spenders E. coli. Ergänzen Sie die Spenderkultur von E. coli mit dem Wirts-Leptospira, um die Konjugation zu erleichtern. Die Konjugation stellt einen direkten Zell-zu-Zell-Kontakt zwischen Organismen her und erleichtert die Aufnahme von Shuttle-Plasmiden durch Leptospira. Im Inneren der Zelle produziert das Plasmidkonstrukt sgRNA-Sequenzen und exprimiert dCas9-Proteine.

Die sgRNA enthält eine Protospacerregion, die ihre komplementäre Zielregion auf der Leptospira-DNA erkennt, in der Nähe des Protospacer-Nachbarmotivs oder PAM - eine kurze Erkennungssequenz auf der Wirts-DNA. Dies hilft dCas9, einen Komplex mit der sgRNA an der Zielstelle stromabwärts der Startstelle der Gentranskription zu bilden.

dCas9 aus dem sgRNA-dCas9-Komplex hat nicht die katalytische Aktivität, um DNA-Stränge zu spalten, stattdessen fungiert es als physikalische Barriere für die Bewegung von mRNA-bildenden RNA-Polymerase-Enzymen und hemmt schließlich die Gentranskription. Verwenden Sie das genstummgeschaltete Leptospira für weitere Tests.