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Biological Techniques
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Inducible Tet-On Regulatable System-Based Gene Expression In Vivo: A Tetracycline-Induced Gene Expression System for Target Gene Transcription Activation in Mouse Model

Induzierbare Tet-On-regulierbare systembasierte Genexpression in vivo: Ein Tetracyclin-induziertes Genexpressionssystem für die Aktivierung der Zielgentranskription im Mausmodell

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Transcript

Das Tetracyclin-On- oder Tet-On-System ist ein bedingtes Genexpressionssystem, das die Expression eines Gens von Interesse in Gegenwart von Tetracyclin oder seinem Analogon Doxycyclin aktiviert.

Beginnen Sie mit einer gentechnisch veränderten Maus mit einem modifizierten Genom, das ein Gen enthält, das für das reverse Tetracyclin-kontrollierte transkriptionelle Aktivatorprotein (rtTA) kodiert, das von einem leberspezifischen Promotor in den Leberzellen oder Hepatozyten gesteuert wird. Zusätzlich enthält die Maus ein Gen von Interesse, das unter der Kontrolle von Tetracyclin-Operator- oder tetO-Sequenzen steht, die sich stromaufwärts befinden und selektiv mit einem minimalen Promotor fusioniert sind. Das tetO und der Promotor werden als Tetracyclin-responsives Element oder TRE bezeichnet.

Das exprimierte rtTA - ein Fusionsprotein, das aus dem Tet-Repressor, tetR und der Transaktivierungsdomäne des viralen Proteins VP16 besteht - bildet Dimere, die inaktiv sind und nicht an die tetO-Sequenz der TRE binden können, wodurch die Aktivierung der Zielgenexpression verhindert wird.

Bereiten Sie eine Lösung vor, die Doxycyclin und Saccharose enthält. Die Zugabe von Saccharose erhöht die Schmackhaftigkeit. Geben Sie nach dem Filtern die Doxycyclin-Saccharose-Lösung als Trinkwasser für die Maus. Das verabreichte Doxycyclin reichert sich in der Leber an.

In den Hepatozyten bindet Doxycyclin an das rtTA, was zu einer Konformationsänderung und einer erhöhten Affinität für die tetO-DNA-Bindungsstelle führt. Die tetR-DNA-Bindungsdomäne von Doxycyclin-gebundenem rtTA bindet an die tetO-Sequenz des TRE-Elements. Die VP16-Domäne rekrutiert weiter RNA-Polymerase, was zur Transkription, zur Bildung von mRNA und zur anschließenden Expression des nachgeschalteten Reporterzielgens führt.

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