siRNA Reverse Transfection-basiertes Gen-Silencing in vitro: Ein Verfahren zur Verabreichung kleiner interferierender RNA in kultivierten Zellen zur Inaktivierung der Zielgenexpression

Für die reverse Transfektion von kleiner interferierender RNA oder siRNA, einer Klasse doppelsträngiger RNA, in nicht-adhärente Adipozyten oder Fettzellen wird eine Suspension von siRNAs hergestellt, die auf ein spezifisches proteinkodierendes Gen in Adipozyten abzielt. Fügen Sie ein geeignetes Transfektionsreagenz auf kationischer Lipidbasis hinzu. Inkubieren Sie das Gemisch, um durch elektrostatische Wechselwirkungen Transfektionskomplexe zu bilden.

Übertragen Sie die Mischung in kollagenbeschichtete Vertiefungen einer Multi-Well-Platte. Die Transfektionskomplexe immobilisieren sich auf der Plattenbeschichtung durch unspezifische Wechselwirkungen. Pipettieren Sie eine Suspension von Adipozyten in Vertiefungen, die immobilisierte Transfektionskomplexe enthalten. Die Adipozyten haften locker an der Plattenbeschichtung, wodurch der physikalische Kontakt zwischen den Zellen und Komplexen erhöht wird.

Der Transfektionskomplex verschmilzt mit der Zellmembran und gibt die siRNA in das Zytoplasma ab. Die siRNA, bestehend aus einem Antisense-Strang mit einer komplementären Sequenz zur Ziel-mRNA und einem Sinnesstrang, wird durch den Multi-Protein-RNA-induzierenden Silencing-Komplex (RISC) erkannt. Die siRNA bindet an den RISC, und die Stränge trennen sich, wobei der Antisense-Strang an den Komplex gebunden bleibt.

Der aktivierte siRNA-RISC-Komplex erkennt und bindet an die komplementären Stellen auf der Ziel-mRNA. Dies führt zu einer sequenzspezifischen Spaltung der mRNA durch das Argonautenprotein des RISC-Komplexes. Die gespaltene mRNA wird von der zellulären Maschinerie weiter abgebaut, wodurch die Expression des Zielgens stummgeschaltet wird.