Induzierbares Tet-Off-regulierbares System: Eine In-vitro-Methode zur Modulation der Genexpression in kultivierten Zellen mit dem Tetracyclin-Off-System

Beginnen Sie mit der Einnahme einer Suspension von kultivierten Empfängerzellen in einem Röhrchen. Ergänzen Sie das Röhrchen mit induzierbaren Plasmiden, die das gewünschte Gen enthalten. Die Expression dieses Gens steht unter der Kontrolle einer vorgeschalteten Promotorsequenz, die mit einem Tetracyclin-Operator oder TeTo fusioniert ist und ein Tetracyclin-responsives Element oder TRE bildet.

Fügen Sie zusätzlich regulatorische Tetracyclin-off-Vektoren hinzu, die jeweils ein Gen enthalten, das für das rekombinante Tetracyclin-Transaktivatorprotein oder tTA kodiert. Elektropopolieren Sie das Zell-DNA-Gemisch, um elektrische Impulse zu verwenden, um die Aufnahme von Plasmiden durch die Zelle zu erleichtern.

Nach der Elektroporation die Zellen plattieren und für die gewünschte Zeit inkubieren. Beim Eintritt in den Zellkern exprimiert der Tetracyclin-off-Vektor das tTA-Protein. Das tTA ist ein Hybridprotein, das einen Tet-Repressor oder die TetR-Einheit und eine virale VP16-Transkriptionstransaktivatordomäne enthält.

Die TetR-Einheit bindet die TetO-Sequenz des TRE-Elements, während die VP16-Domäne es der RNA-Polymerase ermöglicht, die mRNA aus der nachgeschalteten DNA zu synthetisieren, was schließlich zur Genexpression führt. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium in der Kulturplatte durch Doxycyclin-haltiges Medium und inkubieren Sie.

Doxycyclin - ein synthetisches Tetracyclin-Analogon - bindet an das TetR-Protein und verändert dessen Konformation. Diese Veränderung stört die Interaktion des TetR-Proteins mit der TetO-Sequenz und hemmt die Expression des Zielgens.