Binäre bakterielle künstliche Chromosomenvektor-basierte Gentransformation in Arabidopsis-Pflanzen: Eine Technik zur Erzeugung transgener Pflanzen mit Single-Copy-Insertion

Beginnen Sie mit Arabidopsis-Pflanzen, die unreife Blütenköpfe tragen. Tauchen Sie die Blütenköpfe in eine Agrobacterium-Zellsuspension mit T-DNA, die mit binärem bakteriellem künstlichem Chromosom oder BIBAC kloniert wurde, einem Vektor, der sich sowohl in E. coli- als auch in Agrobacterium-Systemen repliziert. Dieser binäre T-DNA-Vektor kann große Transgene wie Herbizidresistenzgene und fluoreszierende selektierbare Marker entlang eines samenspezifischen Promotors liefern.

Während die Blütenköpfe noch eingetaucht sind, rühren Sie die Pflanzen vorsichtig, um ihren Kontakt mit Agrobacterium zu verbessern. Mit seiner inhärenten Fähigkeit, Pflanzen zu infizieren, überträgt Agrobacterium das Transgen in die Blütenzelle. Wenn das Transgen in die Zelle eindringt, wandert es zum Zellkern und verschmilzt mit dem Pflanzengenom.

Wickeln Sie die Pflanze nun in Frischhaltefolie ein und inkubieren Sie im Dunkeln, um die Feuchtigkeit für eine bessere Umwandlung zu speichern. Entfernen Sie die Folie und züchten Sie die Pflanzen unter physiologischen Bedingungen, bis sie Samen produzieren.

Ernten Sie anschließend die Samen und beobachten Sie unter dem Fluoreszenzmikroskop, um Transformanten auszuwählen. Züchten Sie nun die umgewandelten Samen unter geeigneten Bedingungen bis zur Keimung. Besprühen Sie die Pflanzen mit Herbizid und inkubieren Sie.

Pflanzen mit multipler Transgen-Insertion erleben ein Gen-Silencing und verwelken, während Pflanzen mit einer Single-Copy-Insertion ein aktives Herbizid-metabolisierendes Enzym exprimieren und die Behandlung überleben. Extrahieren Sie genomische DNA aus den überlebenden Transformanten und führen Sie eine PCR durch, um die Effizienz der Einzelkopie-Insertion zu berechnen.