CRISPR-Verkettungs-vermittelter Knockout mehrerer Gene: Eine Technik zum gleichzeitigen Ausschalten mehrerer Gene durch einen nicht-homologen End-Joining-Signalweg in Darmzellen von Mäusen

Um mehrere Gene gleichzeitig mit dem CRISPR-Verkettungs-Cas9-System auszuschalten, beginnen Sie mit einem Röhrchen mit der Suspension der Darmzellsuspension der Maus. Ergänzen Sie das Röhrchen mit CRISPR-Verkettungsvektoren, die die Expressionskassette für mehrere nebeneinander integrierte Guide-RNAs oder gRNAs enthalten.

Jede gRNA-Kassette ist individuell so konzipiert, dass sie das vorgesehene Gen individuell ausschaltet. Fügen Sie Expressionsvektoren, die für Cas9-Endonuklease kodieren, in dasselbe Röhrchen hinzu. Elektropopolieren Sie das Zell-Plasmid-Gemisch - eine Technik, die elektrischen Strom verwendet, um den Eintritt von Plasmiden in die Zelle zu erleichtern. Im Inneren der Zelle bildet die Co-Expression des CRISPR-Konkatemers und des Cas9-Vektors gRNA-Sequenzen bzw. Cas9-Nukleasen.

Jede gRNA-Sequenz bindet an das entsprechende Cas9-Enzym und bildet mehrere Cas9-gRNA-Komplexe, die an die Zielstellen im Wirtsgenom binden. Diese Bindung aktiviert das Cas9-Enzym, das eine Kerbe in beiden DNA-Strängen stromaufwärts zur Protospacer-Nachbarmotivstelle (PAM) erzeugt. Dies führt zu einem Doppelstrangbruch (DSB) in der Ziel-DNA.

In Ermangelung einer homologen Sequenz zum Zielgen wird der endogene Reparaturmechanismus der Zelle, die sogenannte nicht-homologe Endverbindung, ausgelöst, wodurch die Reparaturproteine und Kinasemoleküle an der Bruchstelle binden können. Später repariert das Ligase-Enzym das DSB, was zu Veränderungen der Zielgensequenz führt. Diese Modifikationen stören die Funktion der Gene, was zu einem Knockout mehrerer Gene führt.