TALEN-vermittelte gezielte Genintegration: Verwendung von sequenzspezifischen Nukleasen für die präzise Insertion von fluoreszierenden Proteingen in hiPSCs

Beginnen Sie damit, die iPSC-Kulturen jeweils einmal mit PBS zu waschen, geben Sie dann 1 Milliliter 37 Grad Celsius sanftes Zelldissoziationsreagenz in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für etwa 5 Minuten. Wenn mehr als 50 % der Zellen vom Kulturgefäß dissoziiert sind, verwenden Sie eine P1000-Pipette, um verbleibende Zellklumpen oder anhaftende Zellen mechanisch aufzubrechen. Geben Sie dann 2 Milliliter E8-Medium in jede Vertiefung und verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die Kulturen weiter in Einzelzellsuspensionen zu zerlegen.

Gießen Sie nun die geernteten Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie sie herunter. Resuspendieren Sie das Pellet in einer minimalen Menge E8-Medium zum Zählen. Nachdem die Lebensfähigkeit der Kulturen durch Trypanblau-Ausschluss sowie ihre ausreichende Dissoziation bestätigt wurden, werden 3 Millionen Zellen in jeweils zwei konische 15-Milliliter-Röhrchen überführt.

Während die Zellen zentrifugieren, stellen Sie das Elektroporationssystem auf das zelltypspezifische Programm für die humane embryonale Stammzelllinie H9 ein. Fügen Sie dann 10 Mikrogramm des homologen Rekombinationsspenders allein zu 1 Pellet für die Kontrollprobe und 10 Mikrogramm des homologen Rekombinationsspenderplasmids zusammen mit 5 Mikrogramm jedes TALEN-Plasmids für die Versuchsprobe hinzu.

Geben Sie als Nächstes 100 Mikroliter vollständige P3-Primärzelltransfektionslösung bei Raumtemperatur zu jedem der Kontroll- und Versuchspellets und resuspendieren Sie die Zellen. Übertragen Sie die Proben in einzelne Küvetten und elektropolieren Sie die Proben. Unmittelbar nach der Transfektion geben Sie 500 Mikroliter E8-Medium bei Raumtemperatur in jede Küvette und überführen Sie dann die transezierten iPSC-Proben tropfenweise in einzelne 10-Zentimeter-Schalen mit embryonalen DR4-Mausfibroblasten.