siRNA Reverse Transfection-basiertes Gen-Silencing in vitro: Ein Verfahren zur Verabreichung kleiner interferierender RNA in kultivierten Zellen zur Inaktivierung der Zielgenexpression

Pipettieren Sie die siRNA mit einem verbesserten Minimum an essentiellem Medium zum Mischen und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie das Transfektionsreagenz und das verbesserte minimal essentielle Medium zur siRNA und pipettieren Sie sie, um sie zu mischen. Inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann die Transfektionsmischung in jede Vertiefung der mit Kollagen beschichteten Platte.

Waschen Sie die Zellen in der 100-Millimeter-Petrischale zweimal mit DPBS. Geben Sie 5X Trypsin in die Zellen und achten Sie darauf, dass die gesamte Oberfläche mit dem Trypsin bedeckt ist. Warten Sie 30 Sekunden und entfernen Sie vorsichtig das Trypsin. Inkubieren Sie die Petrischale für 5 bis 10 Minuten bei 37 °C im Inkubator.

Tippen Sie dann auf die Schale, um die Zellen zu lösen und Zellschäden zu vermeiden. Fügen Sie 10 Milliliter DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10% FCS und 1% Penicillin und Streptomycin hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipettieren Sie das Medium vorsichtig auf und ab, um die Zellen abzulösen und die Zellsuspension zu homogenisieren.

Zählen Sie die Zellen mit einer Malassez-Zählkammer oder einem automatisierten Zellzähler und stellen Sie die Konzentration der Zellen auf 6,25 x 10⁵ Zellen/ml Medium ein. 800 Mikroliter der Zellsuspension pro Vertiefung einer 12-Well-Platte oder 400 Mikroliter der Zellsuspension pro Vertiefung einer 24-Well-Platte, die die Transfektionsmischung enthält, aussäen.

Inkubieren Sie die Platten in einem Zellkultur-Inkubator und stören Sie sie 24 Stunden lang nicht. Ersetzen Sie am nächsten Tag den Überstand vorsichtig durch frisches DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10 % FCS und 1 % Penicillin und Streptomycin und bringen Sie die Zellen wieder in den Inkubator zurück.