Tartrat-resistente saure Phosphatase-Färbung: Eine In-vitro-Technik zum Nachweis von TRAP-Enzym-haltigen kultivierten Osteoklasten

Osteoklasten sind große, kuppelförmige, mehrkernige Zellen, die auf der Knochenoberfläche zu finden sind. Diese Zellen enthalten zahlreiche zytoplasmatische Granula, die reich an tartratresistenter saurer Phosphatase (TRAP) sind - einem Metalloprotein-Enzym, das von der gekräuselten Grenze der Osteoklasten in das Knochengewebe abgesondert wird. Dieses Enzym verdaut die extrazelluläre Matrix und löst die Mineralkristalle auf, wodurch die Knochenresorption erleichtert wird.

Um TRAP-Granulate als zytochemische Marker von Osteoklasten nachzuweisen, nehmen Sie eine Kulturschale mit adhärenten Osteoklasten. Geben Sie TRAP Färbelösung in die Zellen. Diese Lösung umfasst das Substrat - ein phosphathaltiges Naphthholderivat und Weinsäure in einem Puffer, der mit einem Diazoniumsalz ergänzt ist.

Fügen Sie dieser Lösung Essigsäure hinzu, um den sauren pH-Wert aufrechtzuerhalten, der für die TRAP-Färbung erforderlich ist. Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln bei physiologischer Temperatur, um eine optimale TRAP-Enzymaktivität zu erzielen.

Die Färbelösung gelangt in die Osteoklasten, wo die Weinsäure die hydrolysierende Aktivität von tartratempfindlichen sauren Phosphatasen in anderen Zellen hemmt.

Gleichzeitig hydrolysiert TRAP das zugegebene Substrat, um seine Phosphatgruppe zu entfernen. Das hydrolysierte Substrat koppelt mit einem Diazoniumsalz aus der Färbelösung zu einem kastanienbraunen, unlöslichen Farbstoffkomplex. Dieser Komplex fällt als Granulat an den Stellen enzymatischer Aktivität aus.

Bilden Sie die Zellen unter einem Mikroskop ab. Die Ablagerung von kastanienbraunen Farbstoffgranulaten im Zytoplasma bestätigt das Vorhandensein von TRAP-haltigen Osteoklasten in der Kultur.