Digitale Duplex-PCR zur gleichzeitigen Quantifizierung dualer genetischer Marker

Die Duplex-Kettenreaktion der digitalen Polymerase – ddPCR – ermöglicht den gleichzeitigen quantitativen Nachweis von zwei unterschiedlichen genetischen Markern.

Entnehmen Sie zunächst eine Probe mit zwei verschiedenen Zielsequenzen. Fügen Sie eine Mischung hinzu, die ein thermostabiles DNA-Polymerase-Enzym, dNTPs und zielspezifische Primer enthält. Fügen Sie als Nächstes zwei verschiedene zielspezifische Oligonukleotidsonden hinzu, die mit fluoreszierenden Reportern und einem Quenchermolekül markiert sind, um amplifizierte Ziele zu detektieren.

Die Lösung wird mit Öl emulgiert, um die Zielsequenzen in zahlreiche Nanotröpfchen aufzuteilen. Jedes Tröpfchen, das das Ziel enthält, fungiert als einzelnes Reaktionsgefäß.

Starten Sie den thermischen Zyklusprozess für die Amplifikationsreaktion in den einzelnen Nanotröpfchen.

Bei einer hohen Denaturierungstemperatur trennen sich die doppelsträngigen Targets in Einzelstränge.

Senken Sie die Temperatur, um die entsprechende Glühtemperatur zu erreichen, damit die Primer und Oligonukleotidsonden an die Vorlage binden können.

Die Nähe des Quenchers unterdrückt die Fluoreszenz des Reporters. Bei der Verlängerungstemperatur dehnt die DNA-Polymerase die Primer aus und spaltet die Oligonukleotidsonde. Der ungebundene Reporter emittiert Fluoreszenz.

Führen Sie die Tröpfchen durch einen Tröpfchenleser – ein Fluoreszenzdetektionssystem. Die Detektion von einfacher oder doppelter Fluoreszenz weist auf positive Tröpfchen hin, die Ziele enthalten, während das Fehlen eines Signals auf negative Tröpfchen hinweist.

Das Verhältnis der positiven Tröpfchen zur Gesamtzahl der Partitionen bestimmt die Anfangskonzentration der Zielsequenzen.