Quantitative reverse-Transkriptions-PCR in Echtzeit zur Diagnose von Virusinfektionen

Die quantitative reverse-transkription-PCR in Echtzeit ist nützlich für die Identifizierung von Virusinfektionen.

Beginnen Sie mit einer Probe, die die virale Ziel-RNA enthält. Fügen Sie zielspezifische Primer hinzu, die sowohl die DNA-Synthese als auch die Amplifikation unterstützen, zusammen mit reversem Transkriptase-Enzym und dNTPs.

Fügen Sie thermostabile DNA-Polymerase hinzu – ein Enzym zur Amplifikation von DNA über PCR-Zyklen hinweg – und SYBR Green – einen Farbstoff, der in doppelsträngige DNA, dsDNA, interkaliert. Die Reaktion in einen Thermocycler geben. Stellen Sie eine geeignete Temperatur ein, damit die Primer an die Ziel-RNA binden können.

Die reverse Transkriptase fügt dem Primer dNTPs hinzu, während sie gleichzeitig die Matrizen-RNA spaltet und cDNA synthetisiert.

Erhöhen Sie die Temperatur und inaktivieren Sie die reverse Transkriptase. Senken Sie die Temperatur, damit die Primer für die anschließende Amplifikation an der cDNA abgreifen können. Erhöhen Sie die Temperatur, um den Verlängerungsschritt zu erreichen, in dem die DNA-Polymerase die Primer verlängert und dsDNA synthetisiert.

Aufeinanderfolgende Zyklen führen zu einer exponentiellen dsDNA-Amplifikation. SYBR-Grün bindet in zunehmender Zahl an die DNA, was zu einer proportionalen Zunahme der Fluoreszenzemission führt. Plotten Sie das Fluoreszenzsignal, das über die Zyklen hinweg detektiert wurde.

Eine positive Amplifikationskurve zeigt das Vorhandensein von viraler RNA in der Probe an.

Erhöhen Sie die Temperatur schrittweise, um die Schmelztemperatur zu erreichen, und denaturieren Sie die dsDNA in Einzelstränge. Die gebundenen Farbstoffmoleküle werden freigesetzt – und verlieren ihre Fluoreszenz. Plotten Sie die abnehmende Fluoreszenz gegen die Temperatur auf.

Ein Peak, der der virusspezifischen Schmelztemperatur entspricht, bestätigt die Virusinfektion.