Quantitative Polymerase-Kettenreaktion zur Aufzählung von Bakteriophagen

Um Bakteriophagen mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion, qPCR, aufzuzählen, erhalten Sie einen qPCR-Reaktionscocktail, der Taq-DNA-Polymerase, Primer, Desoxynukleotidtriphosphate – dNTPs – und fluoreszierende Reporterfarbstoffmoleküle in einem optimierten Puffer enthält. In die Vertiefungen einer qPCR-Platte überführen.

Fügen Sie wärmebehandelte Bakteriophagen hinzu. Bei der Wärmebehandlung wird die DNA von Bakteriophagen aus Bakteriophagenpartikeln freigesetzt. Versiegeln Sie die Platte, um die Verdunstung der Mischung zu verhindern. Legen Sie die Platte in das qPCR-System ein und stellen Sie geeignete Zyklusbedingungen ein.

Durch das Erhitzen auf hohe Temperaturen wird die doppelsträngige DNA in Einzelstränge denaturiert. Es aktiviert auch die Taq-DNA-Polymerase. Das Annealing bewirkt, dass sequenzspezifische Primer an die komplementären DNA-Stränge der Bakteriophagen binden. Die Verlängerung ermöglicht es der aktivierten Taq-DNA-Polymerase, dNTPs an das 3'-Ende des Primers anzuhängen, wodurch der wachsende DNA-Strang in 5'- bis 3'-Richtung verlängert wird.

Die Farbstoffmoleküle interkalieren in die neu synthetisierte doppelsträngige DNA, was zu einer erhöhten Fluoreszenzintensität führt. Jeder PCR-Zyklus verdoppelt die Ziel-DNA-Menge und erhöht die Fluoreszenzintensität.

Bestimmen Sie den Schwellenwert für den Ct-Wert, bei dem die gemessene Fluoreszenz den Hintergrundwert überschreitet.

Der Ct-Wert steht in umgekehrtem Verhältnis zur Ausgangs-DNA-Menge, wobei jedes Bakteriophagen-Genom einem Bakteriophagen-Partikel entspricht, was die Quantifizierung von Bakteriophagen anhand der DNA-Standardkurve der Bakteriophagen erleichtert.

Führen Sie nach der Intensivierung eine Schmelzkurvenanalyse durch und erhöhen Sie die Reaktionstemperatur allmählich. Bei einer bestimmten Schmelztemperatur trennt sich die Hälfte der DNA in Einzelstränge, wodurch Farbstoffmoleküle freigesetzt und eine plötzliche Abnahme der Fluoreszenz verursacht wird.

Eine ausgeprägte Schmelztemperatur, die für das qPCR-Produkt einzigartig ist, bestätigt die Produktspezifität.