Chip-in-a-Tube-basierte digitale PCR zur Quantifizierung von Einzelnukleotidvarianten

digitale Polymerase-Kettenreaktion – oder dPCR – ist nützlich für die Quantifizierung von Einzelnukleotidvarianten – oder SNVs – einer Mutation, bei der die Substitution eines einzelnen Nukleotids an einer bestimmten Position im Genom zwei Nukleotidvariationen oder Allele erzeugt.

Um mit der Quantifizierung mit der Chip-in-a-Tube-dPCR-Technik zu beginnen, entnehmen Sie eine DNA-Probe, die SNVs enthält – das mutierte Allel und das entsprechende Wildtyp-Allel. Fügen Sie eine Mischung hinzu, die ein thermostabiles DNA-Polymerase-Enzym, dNTPs und Primer enthält.

Fügen Sie als Nächstes allelspezifische Oligonukleotidsonden hinzu, die mit Reportern verschiedenfarbiger Fluoreszenz markiert sind, um zwischen den Allelen zu unterscheiden, und ein Quenchermolekül. Die Nähe des Quenchers zum Reporter unterdrückt dessen Fluoreszenz.

Partitionieren Sie die Lösung in die Reaktionskammern eines mikrofluidischen Chips. Jede Kammer, die ein Allel enthält, dient als unabhängiges Reaktionsgefäß.

Legen Sie das Rohr mit dem Chip in einen Thermocycler und starten Sie die Reaktion. Bei hoher Temperatur denaturiert die doppelsträngige DNA zu Einzelsträngen. Senken Sie die Temperatur, um die Primer und Oligonukleotidsonden in ihre komplementären Bereiche zu glühen.

Bei einer geeigneten Verlängerungstemperatur dehnt die DNA-Polymerase die Primer aus und spaltet die Sonde. Die Entfernung zum Quencher ermöglicht die Fluoreszenzemission des Reporters.

Lesen Sie die verschiedenfarbigen Fluoreszenzsignale und erstellen Sie ein Positionsdiagramm, um die Kammern mit den Allelen zu erkennen.

Um die Häufigkeit des mutierten Allels – die Variantenallelfraktion – zu bestimmen, berechnen Sie das Verhältnis der Kammern, die das mutierte Allel enthalten, zum Wildtyp-Allel.