Dot-Blot-Assay zur Quantifizierung des viralen Genoms

Um die virale DNA mit dem Dot-Blot-Assay zu quantifizieren, beginnen Sie mit einer isolierten viralen DNA-Suspension. Mit einer alkalischen Lösung behandeln, um die doppelsträngige DNA für die anschließende Hybridisierung in Einzelstränge zu denaturieren.

Bauen Sie das Dot-Blot-Gerät mit einer vorbenetzten Nylonmembran zusammen. Laden Sie denaturierte virale DNA und linearisierte Standard-Plasmid-DNA-Lösungen in die Vertiefungen. Wenden Sie ein geeignetes Vakuum an, das den effektiven Transfer negativ geladener viraler einzelsträngiger DNA und die Bindung an die positiv geladene Membranoberfläche durch elektrostatische Wechselwirkungen erleichtert, wodurch Punktmuster gebildet werden.

Waschen Sie die Membran nach dem Lauf mit Natriumcitratpuffer, um die Empfindlichkeit des Assays zu verbessern. Setzen Sie die Membran nach dem Trocknen ultraviolettem Licht aus und vernetzen Sie die getleckte DNA mit der Membran.

Geben Sie der Membran ein hitzedenaturiertes, nicht-heterologes DNA-Fragment und eine virale genomspezifische radioaktive, mit Phosphor markierte DNA-Sondensuspension in Hybridisierungspuffer zu. Inkubieren, um die Hybridisierung zu erleichtern.

Die DNA-Fragmente wirken als Blockiermittel, binden an die verbleibenden Membranregionen, wodurch die unspezifische Sondenbindung minimiert wird. Die radioaktive Sonde hybridisiert mit der komplementären Sequenz auf der einzelsträngigen DNA des Virus.

Waschen Sie mit Waschpuffer, um nicht hybridisierte Sonden zu entfernen. Quantifizieren Sie mit dem Phosphor-Bildscanning-System die radioaktiven Signale, die von den radioaktiven Sonden emittiert werden, die mit dem viralen Genom auf der Membran hybridisiert sind, um Dot-Blot-Signale zu erhalten.

Aus der Standardkurve kann die Signalintensität jedes Punktes auf der Membran verwendet werden, um die Menge an viraler DNA in der Probe zu berechnen.