5-Methylcytosin-Dot-Blot zur Bestimmung des Ausmaßes der DNA-Methylierung

Die DNA-Methylierung ist eine epigenetische Modifikation, bei der eine Methylgruppe an die Cytosinbase der DNA angehängt wird, um 5-Methylcytosin zu bilden. Diese Modifikation verändert die Genexpression.

Um die DNA-Methylierung mittels Dot-Blot zu quantifizieren, nehmen Sie genomische DNA-Proben, die von menschlichen Chondrozyten in verschiedenen Stadien der Dedifferenzierung stammen und unterschiedliche Konzentrationen von methyliertem Cytosin aufweisen.

Behandeln Sie die DNA-Proben mit Natriumhydroxid – einem starken Alkali – und erhitzen Sie sie. Diese Behandlung bricht die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden DNA-Strängen auf, was zu einer DNA-Denaturierung führt. Fügen Sie Ammoniumacetat hinzu, um das Alkali zu neutralisieren und einen übermäßigen DNA-Abbau zu verhindern.

Nehmen Sie eine Nylonmembran und punktulieren Sie denaturierte DNA-Proben in Form von Punkten. Die negativ geladene DNA bindet über elektrostatische Wechselwirkungen an die positiv geladene Nylonmembran, was dazu führt, dass sie auf dem festen Träger abgesetzt wird.

Behandeln Sie die gefleckte Membran mit einem Blockierungspuffer, um eine unspezifische Bindung zu verhindern. Als nächstes fügen Sie der Membran Anti-5-Methylcytosin-Antikörper hinzu und inkubieren. Diese Antikörper binden ausschließlich an das methylierte Cytosin auf der DNA.

Waschen Sie, um die ungebundenen Antikörper zu entfernen, und fügen Sie chemilumineszierende, enzymkonjugierte Sekundärantikörper hinzu, die spezifisch an die primären Antikörper binden.

Geben Sie ein chemilumineszierendes Substrat auf die Membran. Das Enzym auf dem Antikörper reagiert mit dem Substrat, um Chemilumineszenz zu erzeugen – was zu Punkten unterschiedlicher Intensität führt.

Bilden Sie die Membran ab und messen Sie die Intensität der Punkte, die dem Ausmaß der DNA-Methylierung in jeder Probe entspricht.