Einzelzell-Western-Blot zur Bestimmung der Zellheterogenität

Entzündungsstellen enthalten verschiedene Immunzellen, darunter Monozyten, Makrophagen und Leukozyten.

Um eine heterogene Zellpopulation durch Einzelzell-Western-Blotting zu identifizieren, wird ein vorhydratisierter Blotting-Chip verwendet, der aus einem photoaktivierbaren Polyacrylamid-Gel besteht, das in Blöcken strukturiert ist. Jeder Block verfügt über zahlreiche Mikrovertiefungen. Bei der Strukturierung in mehrere Blöcke werden mehrere Zellen parallel erfasst.

Fügen Sie eine Suspension hinzu, die eine heterogene Zellpopulation enthält. Die Abmessungen der Vertiefung ermöglichen es, dass sich einzelne Zellen absetzen. Tauchen Sie den Chip in eine Elektrophoresekammer, die mit einem geeigneten Puffer gefüllt ist. Die Detergenzienmoleküle im Puffer stören die Zellmembran und setzen zelluläre Inhalte frei.

Legen Sie ein elektrisches Feld an. Die freigesetzten Proteine wandern durch das Gel und trennen sich in unterschiedlich große Banden. Waschen Sie den Chip mit einem Waschpuffer, um unspezifisch gebundene Moleküle zu entfernen, so dass nur zelluläre Proteine übrig bleiben, einschließlich der gewünschten Markerproteine.

Setzen Sie das Gel UV-Licht aus, wodurch seine Oberfläche aktiviert und die Proteine immobilisiert werden.

Fügen Sie einen Cocktail aus primären Antikörpern hinzu, die spezifisch an Markerproteine binden, die für jeden Zelltyp charakteristisch sind, und Protein-Primärantikörper-Komplexe bilden. Geben Sie eine Mischung aus fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern ab, die an ihre jeweiligen Primärantikörper binden und das entsprechende zellspezifische Markerprotein markieren.

Platzieren Sie den Chip in einem Scanner. Messen Sie die Fluoreszenzintensität, die proportional zum Expressionsniveau des entsprechenden Proteinmarkers ist, der für eine einzelne Zelle der Probenzellsuspension spezifisch ist.