Chemilumineszenz-Western-Blot-Assay für die Proteinverarbeitung

CD95 – ein Todesrezeptor – bindet an seine agonistischen Antikörper und löst den Aufbau eines todbringenden Signalkomplexes (DISC) aus – einem Multiproteinkomplex, der Procasase 8 rekrutiert. An der DISC dimerisiert die Procaspase 8 und verarbeitet sich zu verschiedenen Zwischenspaltprodukten und schließlich zu einer aktiven Form, die die Apoptose einleitet.

Zur Analyse der Caspase-Acht-Verarbeitung mittels chemilumineszierendem Western Blot wird ein Lysat in einem Röhrchen entnommen, das DISC-assoziierte Zwischenspaltungsprodukte von Caspase 8 enthält. Ergänzen Sie dies mit Protein-A-Agarose-Beads-eingefangenen Anti-CD95-Antikörpern. Die Anti-CD95-Antikörper binden an die DISC-Komponente CD95 und bilden Proteinkomplexe.

Laden Sie die Probe auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel, um die unterschiedlich großen immunpräzipitierten Caspase-8-Zwischenprodukte als unterschiedliche Banden zu trennen. Legen Sie das Gel auf eine Löschfolie und legen Sie elektrischen Strom an. Die Caspase-8-Zwischenprodukte bewegen sich aus dem Gel auf die Blotting-Membran.

Behandeln Sie die Membran mit einer blockierenden proteinhaltigen Lösung, um die Proteinbindungsstellen zu sättigen und so unspezifische Bindungen zu verhindern.

Fügen Sie eine Lösung von Primärantikörpern hinzu, die an den Caspase-Acht-Produkten an einer bestimmten Stelle binden.

Fügen Sie enzymmarkierte Sekundärantikörper hinzu, die spezifisch an die komplementäre Fc-Region des Primärantikörpers binden, um einen Caspase-Acht-Spaltprodukt-Primärantikörper-Sekundärantikörper-Komplex zu bilden.

Fügen Sie ein chemilumineszierendes Substrat hinzu, das mit dem sekundären Antikörper-konjugierten Enzym reagiert und Licht emittiert. Die Intensität des emittierten Lichts korreliert mit der Menge des Caspase-Acht-Spaltprodukts.