Southern-Blot zum Nachweis homologer Rekombination im Genom embryonaler Stammzellen der Maus

Beim Southern-Blotting werden bestimmte DNA-Sequenzen aus einem komplexen DNA-Mix durch sondenbasierten Nachweis identifiziert.

Um homologe Rekombinations- oder HR-Ereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern-Blotting zu identifizieren, erhalten Sie genomische DNA aus den Zellen. Inkubieren Sie mit einem Restriktionsenzym, um die DNA in kleinere Fragmente zu verdauen.

Laden Sie die DNA auf ein Agarose-Gel. Führen Sie eine Elektrophorese für die größenbasierte Fragmenttrennung durch.

Behandeln Sie das Gel mit einer sauren Lösung, um Purinbasen zu entfernen und die doppelsträngige DNA, dsDNA, zu lösen. Alkalische Denaturierungslösung zugeben. Der hohe pH-Wert stört die Wasserstoffbrückenbindungen und denaturiert die gelöste dsDNA in einzelsträngige DNA, ssDNA. Inkubieren Sie mit einer neutralisierenden Lösung, um den pH-Wert des Gels zu neutralisieren.

Bauen Sie das Transfersystem aus Löschpapier, einer Nylonmembran und Gel zusammen, die auf der Membran gestapelt sind. Führen Sie die Übertragung durch. Die ssDNA wird vom Gel über die Kapillarwirkung nach unten auf die Membran übertragen.

Bestrahlen Sie die Membran mit ultravioletten Strahlen, vernetzen und immobilisieren Sie die DNA. Legen Sie die Membran in ein Röhrchen, das eine Hybridisierungslösung enthält. Inkubieren Sie mit Rotation, beschichten Sie die Membran und verhindern Sie eine unspezifische Sondenbindung.

Inkubieren Sie schließlich die Membran mit dem Hybridisierungspuffer, der einzelsträngige, radioaktiv markierte Sonden enthält. Die Sonden binden über Sequenzkomplementarität an bestimmte DNA-Regionen.

Waschen Sie die Membran und entfernen Sie die ungebundenen Sonden. Setzen Sie die Membran Röntgenstrahlen aus. Unterschiedliche Banden auf der Membran unterscheiden DNA-Regionen, die HR-Ereignisse enthalten, von Kontrollregionen.