5-Methylcytosin-Dot-Blot zur Bestimmung des Ausmaßes der DNA-Methylierung

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die isolierte DNA 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius in 0,1 molarem Natriumhydroxid denaturieren. Neutralisieren Sie die DNA mit 1 molaren Ammoniumacetat auf Eis und verdünnen Sie sie dann zweifach mit doppelt destilliertem Wasser.

Der kritischste Schritt beim Dot-Blot ist das Flecken der Proben auf der Membran, führen Sie dies langsam und vorsichtig durch. Versuchen Sie, jeden gefleckten Bereich auf einen Durchmesser von 3 bis 4 Millimetern zu minimieren.

Platzieren Sie mit einer Enghalspipettenspitze vorsichtig 2 Mikroliter der seriell verdünnten genomischen DNA auf einer positiv geladenen Nylonmembran in der Mitte des Gitters. Tupfen Sie die Membran bei 80 Grad Celsius 30 Minuten lang ab. Blockieren Sie anschließend die unspezifischen Antikörper-Bindungsstellen, indem Sie die Membran in einer 10 Zentimeter großen Petrischale 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln in 5 % BSA in TBST einweichen.

Waschen Sie die Membran nach 1 Stunde dreimal für jeweils 5 Minuten in TBST. Inkubieren Sie die Membran über Nacht mit einem monoklonalen Anti-5-Methylcytosin-Antikörper der Maus in TBST bei 4 Grad Celsius. Waschen Sie die Membran am nächsten Tag dreimal für jeweils 5 Minuten in TBST.

Dann inkubieren Sie mit einem Sekundärantikörper – Meerrettichperoxidase-konjugiertem Schaf-Anti-Maus-Immunglobulin G in TBST für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Membran wie zuvor in TBST gewaschen haben, fügen Sie der Membran das Enzymsubstrat hinzu und inkubieren Sie sie 5 bis 10 Minuten lang. Visualisieren Sie abschließend das Sekundärantikörpersignal mit einem Chemilumineszenz-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.