Hochgeschwindigkeits-Zeitraffer-Rasterkraftmikroskopie zur Erfassung der Nukleosomendynamik

Nukleosomen – eukaryotische DNA-Repeating-Einheiten – bestehen aus DNA-Segmenten, die um Histon-Proteinkerne gewickelt sind. Die DNA-Enthüllung um den Histonkern ist entscheidend für die Dynamik der Nukleosomen.

Um die Dynamik des Nukleosoms zu erfassen, beginnen Sie mit einem glatten, funktionalisierten Glimmersubstrat, das auf einem Rasterkraftmikroskop, einem AFM, einem Scannertisch montiert ist. Überlagern Sie das Substrat mit einem nukleosomenhaltigen Puffer.

Die negativ geladene Nukleosomen-DNA interagiert mit positiven Ladungen auf dem funktionalisierten Glimmer und immobilisiert sie auf der Oberfläche. Waschen Sie das immobilisierte Glimmersubstrat mit einem Puffer, um eine Überfüllung der Nukleosomen zu verhindern.

Übertragen Sie den nukleosomenhaltigen Scannertisch in eine Bildgebungskammer mit einem vormontierten Cantilever, mit einer Spitze am Rand und nach oben zu den Nukleosomen.

Füllen Sie die Kammer mit einem Imaging-Puffer. Richten Sie den Laserstrahl auf die Auslegerrückseite aus, um genaue Ablenkungsmessungen zu gewährleisten.

Die AFM-Spitze oszilliert nahe an den vollständig umhüllten Nukleosomen und scannt die Oberfläche, um in regelmäßigen Abständen die Höhe der Nukleosomen zu messen.

Die spontane DNA-Enthüllung erhöht die Höhe des Nukleosoms, wodurch sich die Oszillationen der Spitze abwechseln und eine Auslenkung des Cantilevers entsteht. Diese Cantilever-Ablenkung verschiebt die Position des reflektierten Laserstrahls, was von einem positionsempfindlichen Detektor erfasst wird und topographische Nukleosomenbilder erzeugt.

Auf AFM-Bildern erscheint der Histonkern als leuchtender Klumpen mit unverpackter DNA, die im Laufe der Zeit immer höher wird, was auf die Dynamik des Nukleosoms hinweist.