Kernspinresonanzspektroskopie zur Identifizierung mehrerer Phosphorylierungen in Proteinen

Bei mehrfachen Phosphorylierungen in einem Protein werden dem Protein Phosphatgruppen an verschiedenen Positionen hinzugefügt, insbesondere an Serin- und Threoninresten.

Um mehrere Phosphorylierungen in einem Protein zu identifizieren, beginnen Sie mit einem Röhrchen mit phosphorylierten Proteinen, die mit Stickstoff-15 markiert sind, was hilft, Amidwasserstoffe von anderen Wasserstoffatomen im Protein zu unterscheiden.

Fügen Sie eine interne NMR-Referenzverbindung hinzu, um die relativen Resonanzfrequenzen genau zu messen. Gib das Gemisch in ein Kernspinresonanz-Röhrchen (NMR). Setzen Sie den Tubus in eine rotierende Öffnung ein und platzieren Sie ihn in einem NMR-Spektrometer.

Das Vorhandensein von Phosphaten zeigt elektronenentziehende Effekte in den phosphorylierten Serin- und Threoninresten. Infolgedessen scheinen die Amidwasserstoffe der phosphorylierten Reste im Vergleich zu den anderen Amidwasserstoffen mit geringeren Elektronendichten abgeschirmt zu sein.

Amid-Wasserstoffatome mit unterschiedlichen elektronischen Umgebungen erleben differentielle Magnetfelder um Kerne und erreichen so niederenergetische Zustände.

Wenden Sie einen kurzen Hochfrequenzimpuls an, um die Wasserstoffkerne auf einen höheren Energiezustand bei einer bestimmten Resonanzfrequenz anzuregen, die auf ihrer elektronischen Umgebung basiert.

Während der Relaxation kehren die Kerne in einen niederenergetischen Zustand zurück, indem sie die absorbierte Energie freisetzen, die als NMR-Signal detektiert wird.

Zeichnen Sie ein zweidimensionales NMR-Spektrum, das die einzelnen Amid-Wasserstoffatome darstellt.

Vergleichen Sie das Spektrum des phosphorylierten Proteins mit dem des nicht phosphorylierten Proteins. Das Auftreten zusätzlicher Resonanzen im NMR-Spektrum des phosphorylierten Proteins bestätigt mehrere Phosphorylierungen.