Die Zirkulardichroismus-Spektroskopie-Technik zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen

ATP-abhängige Chromatin-Remodeling-Proteine regulieren die Genexpression in dicht gepacktem Chromatin, indem sie die DNA-Konformation auf ATP-abhängige Weise verändern.

Um Chromatin-Remodeler-DNA-Wechselwirkungen mit Hilfe der Zirkulardichroismus- oder CD-Spektroskopie zu untersuchen, nehmen Sie eine Lösung von doppelsträngigen DNA-Oligonukleotiden. Erhitzen, um die Oligonukleotide zu denaturieren, und auf Eis legen.

Durch die schnelle Abkühlung renaturiert die DNA und bildet Sekundärstrukturen. Der Übergangsbereich von Doppel- zu Einzelstrang bietet eine optimale Bindungsstelle für die Chromatin-Remodeler.

Geben Sie die hitzegekühlte DNA in eine Küvette. Fügen Sie einen Puffer hinzu, der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeler, ATP und Magnesiumionen enthält.

Der Remodeler bindet an die DNA, gefolgt von der Bindung von ATP mit Magnesiumionenkomplex an das Protein – und aktiviert es. Der aktivierte Remodeler hydrolysiert ATP – und induziert so eine Stammschleifenkonformation in der DNA.

Lassen Sie links und rechts zirkular polarisiertes Licht – mit einer Phasendifferenz von 90° – durch die Probe. Optisch absorbiert chirale DNA das linke und rechte zirkular polarisierte Licht in unterschiedlichem Ausmaß.

Die differentielle Absorption, die als Zirkulardichroismus bezeichnet wird, führt dazu, dass das transmittierte Licht elliptisch polarisiert wird, was als Elliptizität gemessen wird. Zwei positive Peaks bei bestimmten Wellenlängen in den CD-Spektren bestätigen die Stem-Loop-Struktur.

Fügen Sie EDTA hinzu, um die Magnesiumionen zu chelatisieren und die ATPase-Aktivität zu hemmen.

Eine Änderung der CD-Spektren bei der Chelatbildung – die einen negativen Peak und einen breiten positiven Peak bei bestimmten Wellenlängen zeigt – deutet auf eine Störung der Stamm-Loop-Konformation in Abwesenheit der ATP-Hydrolyse hin.