UV-sichtbare Spektroskopie zur Überwachung der Bildung von Fibringerinnseln

Als Reaktion auf eine Wunde wird durch eine Reihe von enzymatischen Reaktionen die Bildung eines unlöslichen Proteinnetzwerks – eines Fibringerinnsels – eingeleitet, das die Blutgefäße verschließt und einen übermäßigen Blutverlust verhindert.

Um die Bildung von Fibringerinnseln in vitro zu überwachen, beginnen Sie mit einer Multiwell-Platte, die einen Puffer für die Gerinnselbildung enthält. Der Puffer besteht aus Kalziumionen – einem Cofaktor – und Fibrinogenen – löslichen Glykoproteinen, die für die Gerinnung unerlässlich sind.

Behandeln Sie den Brunnen mit den Thrombinen – einem proteolytischen Enzym, das die Reaktion in Gang setzt.

Setzen Sie die Platte in ein UV-sichtbares Spektralphotometer ein. Beleuchten Sie die Vertiefung mit Licht mit einer Wellenlänge von 350 Nanometern und erfassen Sie in regelmäßigen Abständen die Absorption der Lösung.

Zunächst dringt das einfallende Licht durch die klare Lösung, die lösliche Fibrinogene enthält, und zeigt eine minimale Lichtabsorption und eine maximale Durchlässigkeit. Der Detektor sammelt das durchgelassene Licht und erzeugt Spektren, die die Absorption über die Zeit zeigen und mit der Trübung der Lösung korrelieren.

Im Laufe der Zeit spaltet Thrombin in Gegenwart von Kalziumionen die löslichen Fibrinogene, um Fibrine freizusetzen. Diese unlöslichen Fibrine interagieren und bilden ein dreidimensionales Fibrinnetzwerk – ein Gerinnsel – das die Lösung trüb macht. Die trübe Lösung, die das Fibringerinnsel enthält, absorbiert mehr Licht, wodurch die Intensität des durchgelassenen Lichts abnimmt.

Analysieren Sie die UV-sichtbaren Spektren; die Zunahme des Absorptionswertes im Laufe der Zeit korreliert mit einer Zunahme der Trübung der Lösung, was auf eine schnelle Bildung von Fibringerinnseln hindeutet.