Isolierung von Stammzellen aus menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebs Xenografts

Tumorstammzellen oder CSCs besitzen die Fähigkeit zur langfristigen Selbsterneuerung und können differenzierte Tochterzellen hervorbringen. CSCs wurden bei einer zunehmenden Zahl von malignen Erkrankungen identifiziert, darunter das Pankreasadenokarzinom, bei dem sie anhand der Aldehyddehydrogenase-Aktivität sowie der Expression von Oberflächenantigenen wie CD 44, CD 24 und CD 133 nachgewiesen werden können. Hier werden Tumore von Mäusen isoliert, die menschlichen Pankreaskrebs tragen.

Xenotransplantate und Einzelzell-Suspensionen werden hergestellt. Anschließend werden die Zellen mit dem Eldor-Reagenz gefärbt, das Zellen mit hoher Aldehyddehydrogenase-Aktivität sowie die Oberflächenantigene CD 44 und CD 24 identifiziert. Populationen von Krebsstammzellen werden danach mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung isoliert.

Die isolierten Zellen können in verschiedenen nachgeschalteten funktionalen und analytischen Assays verwendet werden. Die Stammzellhypothese ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet in der Krebsbiologie. Im Wesentlichen besagt die Hypothese, dass Tumore phänotypisch und funktionell unterschiedliche Zellsubpopulationen enthalten.

Bestimmte Zellsubpopulationen, die als tumorinitiierende Zellen oder Krebsstammzellen bezeichnet werden, können Tumoren in immundefizienten Mäusen oder Kolonien in vitro-kongener Assays erzeugen. In jüngerer Zeit wird außerdem angenommen, dass Krebsstammzellen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Metastasen sowie bei der therapeutischen Resistenz spielen. Ursprünglich wurden Krebsstammzellen in myeloischen Leukämien unter Verwendung von entweder peripherem Blut oder Knochenmarkproben untersucht.

Jedoch hat sich mit dem Aufkommen der Stammzellbiologie und der Erforschung solider Tumore die Herausforderung ergeben, Einzelzell-Suspensionen herzustellen, die per Flusszytometrie sortiert und anschließend für nachgeschaltete Anwendungen untersucht werden können. Mein Postdoktorand-Kollege Zan wird nun dieses Verfahren demonstrieren. Ich werde mehrere kritische Schritte dieses Protokolls visuell veranschaulichen.

Ausgehend von der Erzeugung einer einzigen Zellsuspension von Tumorzellen aus einem humanen Pankreaskrebs-Xenotransplantat. Anschließend färbe ich die Zellen auf Aldehyddehydrogenase-Aktivität sowie auf mehrere Oberflächenantigene der Zellmembran. Schließlich sortiere ich die Zellen mittels eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers.

Die für dieses Protokoll verwendeten Mäuse tragen subkutane humane Pankreaskrebs-Xenotransplantate. Diese Mäuse wurden zuvor wie folgt erzeugt: frisch gewonnene Tumore von Patienten, die an der Johns Hopkins Hospital einer Operation wegen eines Pankreasadenokarzinoms unterzogen wurden, wurden in zwei bis drei Millimeter große Stücke zerkleinert und subkutan in die Flanken von sechs Wochen alten athymischen Mäusen implantiert.

Wenn die Tumoren etwa 1,5 Kubikzentimeter erreicht hatten, wurden sie exzidiert und in sekundäre Empfängermäuse transplantiert, um den Tumorpool zu vergrößern. Dieses Protokoll beginnt mit der Gewinnung eines subkutanen Tumors aus der Flanke einer anthemer Maus mittels stumpfer Dissektion. Sobald der Tumor entfernt wurde, sollte er unverzüglich in Puffer zur Zelldissoziation gegeben werden.

Als Nächstes wiegen Sie den Tumor und geben Sie ihn dann zurück in 10 Milliliter Zelldissoziationspuffer pro ein Gramm Tumorgewebe, wobei Sie in einer sterilen Biosicherheitswerkbank arbeiten. Überführen Sie den Tumor mit sterilen Rasierklingen und Pinzetten in eine 100 × 20 Millimeter große Kulturschale, die ein Milliliter Zelldissoziationspuffer enthält. Zerkleinern Sie den Tumor mechanisch.

Überführen Sie die Tumorzellsuspension in ein 50-Milliliter-Konischglas, das das restliche Volumen des Zelldissoziationspuffers enthält. Pipettieren Sie anschließend die Tumorzellsuspension zehnmal mit einer fünf-Milliliter-Serologischen Pipette um. Die Tumorstücke sollten klein sein, damit sie die fünf-Milliliter-Serologische Pipette nicht verstopfen, und vortexen Sie die Suspension danach eine Minute lang mit maximaler Geschwindigkeit.

Anschließend die Tumorzellsuspension zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, wobei alle 20 Minuten für jeweils eine Minute vortexiert wird. Nach der zweistündigen Inkubation die Zellsuspension eine Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit vortexieren. Die Zellsuspension durch einen 70-Mikron-Filter geben und in einem frischen 50-Milliliter-Konischgefäß auffangen.

Pipettieren Sie 15 Milliliter DMEM mit 10 % FBS und Pen-Strip, um lebensfähige Zellen weiter von toten Zellen und Gewebeabbauprodukten zu trennen. Pipettieren Sie 15 Milliliter Ficoll-Paque Plus langsam unter die Zellsuspension, um ein Dichtegradienten für die Dichtezentrifugation vorzubereiten. Achten Sie darauf, die beiden Phasen nicht zu vermischen. Zentrifugieren Sie bei 500 × g für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit ausgeschalteter Bremse. Nach der Zentrifugation befinden sich die lebensfähigen Zellen an der Grenzfläche zwischen Ficoll-Paque Plus und dem Puffer zur Zell-Dissociation.

Überführen Sie sie in ein neues 50-Milliliter-Konischglas. Geben Sie frisches DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, zur Zellsuspension, um sie im Verhältnis 1:3 zu verdünnen. Zentrifugieren Sie die isolierten Zellen anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 450 × g. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter Alor-Puffer, der im Alor-Färbekit enthalten ist und in den nachfolgenden Zellfärbeschritten verwendet wird. Verdünnen Sie danach 10 Mikroliter der Zellsuspension mit 10 Millilitern Trypanblau und zählen Sie die vitalen Zellen mithilfe eines Hämozytometers.

Wenn in diesem Schritt eine große Anzahl abgestorbener Zellen oder Gewebeabfälle festgestellt wird, wiederholen Sie die Zellseparation durch Dichtezentrifugation. Die Zellen werden auf Aldehyddehydrogenase-Aktivität gefärbt. Unter Verwendung des AldeFluor-Reagens werden die Zellen außerdem mit mehreren fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen spezifische Oberflächenantigene gefärbt.

Etikettieren Sie sieben 12 × 75 Millimeter große Polystyrolteströhrchen und stellen Sie sie auf Eis. Verdünnen Sie die Zellsuspension in zwei Milliliter Eldor-Puffer auf eine Endkonzentration von fünf bis 10 Millionen Zellen pro Milliliter und bewahren Sie sie auf Eis auf. Bereiten Sie anschließend gemäß den Anweisungen im beigefügten schriftlichen Protokoll die folgenden Proben vor, um Kompensationskontrollen auf dem FAX-Gerät einzustellen.

Flusszytometer: Erstens nicht mit ST gefärbte Kontrollzellen. Zweitens Zellen gefärbt mit CD44 APC. Drittens Zellen gefärbt mit CD24 PE und viertens Zellen gefärbt mit Maus-CD31 Biotin, Maus-Linie Biotin, Maus-H-2KD Biotin und Streptavidin PerCP. Bereiten Sie außerdem eine fünfte Probe nur mit ALOR sowie eine sechste Probe zur Einstellung der ALDH-positiven sowie CD44-positiven und CD24-positiven Tore vor.

Diese Probe enthält ELDOR DEAB, einen Inhibitor der Aldehyddehydrogenase, sowie isotopische Kontrollantikörper. IgG zwei B Kappa a PC IgG zwei a Kappa PE Maus CD 31 Biotin Maus Lineage, Biotin Maus, H zwei KD, Biotin und Streptavidin pro cp. Anschließend färben Sie die Zellen im letzten Reaktionsgefäß mit Alor CD 44 A PC CD 24 PE Maus CD 31 Biotin Maus Lineage, Biotin Maus, H zwei KD, Biotin und Streptavidin pro cp.

Dies ist die eigentliche Probe, die nach Abschluss aller Färbungen sortiert werden soll. Bewahren Sie die Röhrchen bis zur Zellsortierung im Dunkeln auf Eis. Dieses Sortierprotokoll führt zur Isolierung von A LDH-positiven, CD 44-positiven, CD 24-positiven pankreatischen CSCs. Unmittelbar vor der Sortierung fügen Sie zwei Milligramm pro Milliliter Propidiumiodid dem A L DH-positiven, CD 44-positiven, CD 24-positiven Gating-Röhrchen hinzu, um nicht lebensfähige Zellen mittels der nicht-ST-gefärbten CD 44 A PC-, CD 24 PE-Maus-Lineage- und Alor-Zellen auszuschließen, und stellen Sie die Kompensationskontrollen auf einem FIA-Fluss ein.

Das Cytometer erzeugt Tore basierend auf den Parametern der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung, um einzelne Zellen zu sammeln. Verwenden Sie die nicht ST-gefärbten und die Maus-Lineage-Röhrchen, um ein Tor für nicht verwendete, CP-negative und vitalitätsfähige, propidiumiodid-negative Zellen unter Verwendung des FL-3-Kanals zu erstellen. Die meisten humanen pankreatischen Xenotransplantate enthalten 20 bis 60 % mausstämmige Zellen, ermittelt mittels des Maus-CD31-Maus-Lineage-Cocktails und Maus-H-2-kD.

Biotin-konjugierte Antikörper unter Verwendung der mit DEAB behandelten Zellen erzeugen Tore im FL1-Kanal für A LDH-positive Zellen. Die Häufigkeit der A L DH-positiven Population aus verschiedenen Xenotransplantaten ist variabel, beträgt jedoch im Allgemeinen ein bis vier Prozent der gesamten Zellpopulation. Anschließend werden die Zellen zum Sortieren in den Fax-Port gegeben und mithilfe dieser Tore ausgewertet.

Sammeln Sie A LDH-positive Zellen in 12 × 75 mm Polystyrol-Teströhren, die ein Milliliter DMEM mit 10 % FBS enthalten. Erstellen Sie danach Schwellenwerte, die anhand von Zellen generiert wurden, die mit eldor IgG zwei B kappa a PC und IgG zwei a kappa PE in den Kanälen FL vier und FL zwei gefärbt wurden. Sammeln Sie anschließend CD44-positive und CD24-positive Zellen, die in der Regel 0,2 bis 5 % der Gesamtanzahl der Zellen ausmachen, nachdem jede Zellpopulation sortiert wurde.

Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 450 ×g für 10 Minuten und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Milliliter frischem DMEM, ergänzt mit 10 % FBS. Zählen Sie die Anzahl der sortierten Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Dieses Verfahren führt zur Isolierung lebensfähiger pankreatischer CSCs. Diese Zellen können für eine Reihe analytischer und funktioneller Assays verwendet werden, die lebensfähige Zellen erfordern.

Wir haben sie verwendet, um das klonogene Wachstum und die Invasion in vitro zu messen. Wir haben sie verwendet, um die Tumorbildung und Metastasenbildung in vivo zu untersuchen, und wir haben sie zur Durchführung vergleichender genetischer Analysen eingesetzt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in etwa sieben Stunden durchgeführt werden.

Es gibt mehrere Schritte, die entscheidend für die Gewinnung einer reinen Population lebensfähiger Zellen sind. Zunächst weisen Xenotransplantate, deren größter Durchmesser weniger als einen Zentimeter beträgt, den geringsten Anteil an nekrotischem Gewebe innerhalb der Tumore auf. Dies gewährleistet, dass die endgültige Population der isolierten Zellen durch möglichst wenige nicht lebensfähige Zellen und Gewebereste kontaminiert wird.

Zweitens ist es bei der Herstellung einer einzelnen Suspension von Tumorzellen wichtig, schnell zu arbeiten und die Zellen oder den Tumor in Medium mit 10 % Serum zu halten, um die Zellviabilität zu verbessern. Drittens ist es, sobald die Zellfärbung mit dem Alde-Fluor-Reagenz und den Antikörpern begonnen hat, wichtig, die Zellen auf Eis zu lagern und sie im Alor-Puffer zu belassen, um die Menge an Einfluss des Alor-Reagenzes aus den Zellen zu verringern. Zusätzlich ist es wichtig, die Zellen so weit wie möglich im Dunkeln zu halten, um die Photobleiche der Fluorofarbstoffe zu reduzieren.

Schließlich ist das manuelle Zählen der Zellen mit einem Hämozytometer wichtig, da der Durchflusszytometer häufig ungenaue Zellzahlen liefert.