Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Pseudomonas aerogene Biofilme an der apikalen Oberfläche lebender menschlicher Atemwegsepithelzellen zu züchten. Dies wird erreicht, indem zunächst eine konfluente Monoschicht aus Epithelzellen der Atemwege auf einer Kunststoffoberfläche oder einem Glasdeckglas etabliert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, eine Kultur von p aerogenen Bakterien konstitutiv zu züchten, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren.

Der nächste Schritt besteht darin, die Bakterien und Atemwegszellen entweder in einer statischen Umgebung oder in einer Strömungskammer miteinander in Kontakt zu bringen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, bakterielle Biofilme im Laufe der Zeit entwickeln zu lassen und gleichzeitig die Lebensfähigkeit der Atemwegszellen zu beurteilen. Es können Ergebnisse erzielt werden, die die Biofilmbildung auf lebenden Atemwegszellen durch Fluoreszenzmikroskopie zeigen.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Mukoviszidose-Patienten, da diese Co-Kulturmodelle zur Entwicklung und Validierung neuer Antibiotika-Therapien verwendet werden können, die in der Lage sind, Biofilme zu beseitigen, die für die chronische Besiedlung der Atemwege verantwortlich sind. Bei Mukoviszidose-Patienten verwendet das statische Co-Kultur-Biofilmmodell CFBE-Zellen, die immortalisierte menschliche Atemwege sind. Epithelzellen, die ursprünglich sieben bis 10 Tage vor der bakteriellen Inokulation von einer Person mit Mukoviszidose entwickelt wurden, säten die CFBE-Zellen in einer 24-Well-Gewebekulturplatte aus.

Wir säen Zellen in einer Konzentration von zwei mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Vertiefung in 0,5 Milliliter minimales essentielles Medium oder MEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, zwei millimolaren L-Glutamin, 50 Einheiten pro Milliliter, Penicillin und 50 Mikrogramm pro Milliliter. Streptomycin züchtet die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. 95 % Luft für sieben bis 10 Tage, wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage.

Diese Bedingungen führen zur Bildung einer konfluenten Monoschicht und enger Verbindungen einen Tag vor dem Experiment. Beimpfen Sie eine Fünf-Milliliter-LB-Kultur mit Pierro Gen aus einer gefrorenen Brühe und züchten Sie 18 Stunden bei 37 Grad Celsius auf einem Rotator. Bei 200 U/min verwenden wir das p-Aerogen, das das PSMC 21-Plasmid trägt, für die konstitutive Expression von GFP am Tag der bakteriellen Inokulation.

Entfernen Sie das Medium aus den CFPE-Zellen und fügen Sie ein gleiches Volumen an Mikroskopiemedium hinzu, das MEM ohne Phenolrot ist, ergänzt mit zwei millimolaren L-Glutamin-inokulat-Confluenz, CFBE-Monoschichten mit posa bei einer Infektionsmultiplizität von etwa 30 zu eins relativ zur Anzahl der CFBE-Zellen, die ursprünglich für eine 24-Well-Platte ausgesät wurden. Dies entspricht 1,2 mal 10 der siebten KBE pro Milliliter in 0,5 Millilitern MEM pro Milliliter. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft.

Entfernen Sie nach der einstündigen Inkubation die Schlinge und ersetzen Sie sie durch frische Mikroskopie. Medium ergänzt mit 0,4% Arginin. Die Zugabe von Arginin verzögert die Zerstörung der Monoschicht so lange, dass sich Biofilme auf den CFPE-Zellen bilden können.

Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, 95 % Luft für verschiedene Zeitpunkte bis zu etwa acht Stunden alle paar Stunden. Analysieren Sie die Integrität der CFBE-Monoschicht und das Wachstum des Biofilms mit Hilfe der Mikroskopie. Das Co-Kultur-Biofilmmodell der Flusszellen erfordert die Bildung einer konfluenten Monoschicht aus CFBE-Zellen auf einem Glasdeckglas mit einem Durchmesser von 40 Millimetern.

Um dies zu erreichen, legen Sie zunächst einen sterilen Abdeckschlüpfer in eine sterile Kunststoffschale mit einem Durchmesser von 60 Millimetern. Fügen Sie dann drei Milliliter vorwarmes Zellwachstum hinzu, drücken Sie mit der Spitze der Pipette auf das Deckglas, um darunter eingeschlossene Blasen zu entfernen, und drücken Sie das Deckglas auf den Boden des Saatguts der Kunststoffschale, zweimal 10 bis zur sechsten CFBE-Zellen pro Schale. Schütteln Sie die Schale vorsichtig hin und her, aber vermeiden Sie das Schwenken, um zu verhindern, dass die Zellen gegen die Seiten der Schale zentrifugieren.

Stellen Sie das Gericht für acht bis 10 Tage in einen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft bei 37 Grad Celsius. Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag mit drei Millilitern frischem Wachstumsmedium. Unter diesen Bedingungen bilden die Zellen eine konfluente Monoschicht auf dem Glasdeckglas.

Der nächste Schritt besteht darin, den aerogenen Bakterienstamm P einen Tag vor dem Experiment vorzubereiten. Züchten Sie p Aerogen in fünf Millilitern LB für 18 Stunden bei 37 Grad Celsius auf einem Rotator. Bei 200 U/min verwenden wir den P-Aerogenstamm, PO eins, der das PSM C 21-Plasmid für die konstitutive Expression von GFP am Tag des Experiments trägt.

Geben Sie einen Milliliter Bakterienkultur in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es drei Minuten lang bei 6.000 U/min. Waschen Sie das Bakterienpellet zweimal in einem Milliliter Mikroskopie. Medium verdünnen 0,5 Milliliter gewaschener und resuspendierter Bakterien in 4,5 Milliliter Mikroskopiemedium, um eine Konzentration von etwa fünfmal 10 der achten KBE pro Milliliter zu erreichen.

Jetzt sind wir bereit, die CFPE-Zellen in Echtzeit zu beobachten, was eine Bildgebungskammer erfordert, die mit einer Peristaltikpumpe gekoppelt ist, um einen Nährstofffluss über einen längeren Zeitraum zu gewährleisten. Und als Temperaturregler verwenden wir eine Standard-Biofilm-Durchflusszellenvorrichtung. Das Biotech-FCS ist mit zwei Kammern für die Aufnahme von CFPE-Zellen modifiziert.

Einer der kritischsten Schritte im Co-Kultur-Biofilmmodell der Flusszelle ist der Zusammenbau der Kammer, ohne den Zellmonitor zu beschädigen Um die Kammer zusammenzubauen. Halten Sie die obere Hälfte der Kammer auf den Kopf, so dass die Perfusionsschläuche sichtbar sind, und richten Sie die Durchgangslöcher einer 0,75 Millimeter dicken Gummidichtung auf den Perfusionsschläuchen aus. Stapeln Sie den mit der Kammer gelieferten Mikro-Aquäduktschieber auf die Gummidichtung und stellen Sie sicher, dass die gerillte Seite nach oben zeigt.

Platzieren Sie dann eine weitere Gummidichtung auf der Rutsche. Die Dicke und die innere Geometrie dieser zweiten Dichtung bestimmen das Volumen der Kammer. Fügen Sie als nächstes einen Milliliter vorwarmes Mikroskopiemedium hinzu In der Mitte des Objektträgers.

Stellen Sie die Bildgebungskammer auf eine sterile Oberfläche, während Sie die CFPE-Zellen aus dem Zellkultur-Inkubator entnehmen. Nehmen Sie das verbrauchte Medium aus der Schale und waschen Sie die CFPE-Zellen einmal mit drei Millilitern vorwarmem Mikroskopiemedium. Mit einer mit Ethanol gewaschenen Pinzette.

Nehmen Sie den Deckglas aus der Schale und senken Sie ihn kopfüber auf die auf die Kammer gelegte Mikroskopie-Mediumperle. Der Deckglas liegt nun auf der zweiten Gummidichtung auf und die Monoschicht der Atemwegszellen zeigt nach unten. Halten Sie die zusammengebauten Komponenten in einer Hand, legen Sie den Boden der Kammer auf den Stapel und drehen Sie die Kammer schnell um, so dass alles mit der richtigen Seite nach oben zeigt.

Verriegeln Sie die Basis, indem Sie den Ring drehen. Verbinden Sie den Einlassschlauch mit der Mikroperfusionspumpe mit geringem Durchfluss. Ein zweites Schlauchstück verbindet die Pumpe mit einem Mikroskopiemedium, das in das 37 Grad Celsius heiße Wasserbad gestellt wird.

Direkt neben dem Mikroskop gelegen. Starten Sie den Durchfluss mit einer Geschwindigkeit von 20 Millilitern pro Stunde. Diese Durchflussmenge liegt innerhalb der Schwimmgeschwindigkeit von posa.

Befestigen Sie einen sterilen, vorgeschnittenen 16. CFL-Schlauch an den Einlass- und Auslassperfusionsröhrchen der Kammer und schließen Sie dann den Temperaturregler an. Stellen Sie die zusammengebaute Kammer auf den Mikroskoptisch eines inversen Fluoreszenzmikroskops. Mit einer Ein-Milliliter-Einwegspritze.

Injizieren Sie die zuvor vorbereitete Bakteriensuspension mit einem Zweiwegeventil, das in einer Linie zwischen der Pumpe und der Kammer angeordnet ist, in die Kammer, damit sich die Bakterien an den Atemwegszellen anheften können. Stoppen Sie die Pumpe für zwei Stunden. Nach zwei Stunden kann der Fluss wieder aufgenommen und bei 20 Millilitern pro Stunde gehalten werden.

Überwachen Sie für den Rest des Experiments die Integrität der Atemwegszellen durch differentielle Interferenzen. Kontrastmikroskopie während des gesamten Experiments, um auf Anzeichen einer Schädigung der Monoschicht zu prüfen. Gleichzeitig folgt die Entwicklung von GFP-markierten p aerogenen Biofilmen an der apikalen Oberfläche von Atemwegszellen.

Durch die Aufnahme von Bildern mit einem inversen konfokalen oder Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop sowohl im statischen als auch im Durchflusszellen-Assay wurde festgestellt, dass die CFPE-Monoschicht dem Vorhandensein von p Aerogen bis zu acht Stunden nach der Inokulation standhalten konnte, ohne dass es Anzeichen einer Veränderung gab. Die Integrität der epithelialen Monoschicht kann durch Phasenkontrastmikroskopie unter Verwendung einer invertierten beurteilt werden, wie dieses Beispiel einer konfluenten Monoschicht aus CFPE-Zellen zeigt, die auf Gewebekulturplatten gezüchtet wurden. Im Laufe der Zeit produziert das p Aerogen Toxine und Virulenzfaktoren, die die Monoschicht der Epithelzellen vollständig oder in Abschnitten schädigen können.

In diesem Beispiel einer kompromittierten CFPE-Monoschicht sind die grün dargestellten P-Aerogenbakterien zu sehen, die sich zwischen den Tight Junctions der Epithelzellen ausbreiten und Zugang zu den basolateralen Membranen erhalten. Die Biofilmbildung wird unter diesen Bedingungen typischerweise nicht erreicht, da sich die Monoschicht verschlechtert. Dieses Bild zeigt einen überwucherten p aerogenen Biofilm, der 24 Stunden nach der Inokulation nach erfolgreicher Unterstützung der Biofilmbildung beobachtet wurde.

Die CFPE-Monoschicht war irreparabel beschädigt und ist heute praktisch nicht mehr vorhanden. Es ist zu sehen, wie sich ein Restbiofilm, der als flache Bakterienschicht wächst, an dem Glasdeckglas festsetzt. Wenn die Integrität der Monoschicht der Atemwege nicht beeinträchtigt wird.

P-Aerogen-Biofilme können sich in beiden Co-Kulturmodellen erfolgreich an der apikalen Oberfläche von Atemwegszellen bilden und entwickeln. Hier ist ein repräsentatives Bild eines A-GFP-exprimierenden p-Aerogen-Biofilms zu sehen, der auf einer konfluenten Monoschicht von CFPE-Zellen unter Verwendung des statischen Co-Kultur-Biofilmmodells gezüchtet wurde, das durch Epi-Fluoreszenzmikroskopie bewertet wurde. Das Bild ist eine Überlagerung des Gesichtskontrastkanals und des Fluoreszenzkanals.

Das nächste Bild zeigt ein GFP mit der Bezeichnung p aerogen. Der Biofilm züchtete sechs Stunden lang auf einer konfluenten Monoschicht von CFBE-Zellen unter Verwendung des Flusszellen-Co-Kultur-Biofilmmodells, um die Visualisierung der Atemwege zu erleichtern. Monolagenkerne wurden vor der Inokulation mit Posa mit HEXT 3 33 42 gefärbt und erscheinen blau gefärbt.

Filme, die als grüne Klumpen an der apikalen Oberfläche der CFPE-Zellen haften, werden über die Atemwegszellen verteilt. Hier sind die typischen pilzartigen Strukturen von sechs Stunden alten aerogenen Biofilmen, die sich nach der 3D-Rekonstruktion auf der A-C-F-P-E-Zellmonoschicht bilden, dargestellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie bakterielle Biofilme auf einer etablierten Monoschicht von Atemwegszellen erfolgreich züchten und visualisieren können, indem Sie die hier beschriebenen Co-Kulturmodelle verwenden und mit mikrobiologischen Standardmethoden und Fluoreszenzmikroskopie koppeln.