Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

Ziel dieses Verfahrens ist es, funktionelle antigenspezifische T-Zell-Rezeptoren auf T-Zellen der Maus zu exprimieren. Zuerst wird eine retroviral produzierende Zelllinie mit einem Plasmid transfiziert, das das interessierende TCR-Gen enthält, um TCR-exprimierende Retroviren zu verpacken. Als nächstes isolieren und reinigen Sie T-Zellen aus der Milz der Maus, infizieren Sie diese gereinigten T-Zellen mit dem im ersten Schritt produzierten Retrovirus.

Expandieren Sie schließlich die transduzierten T-Zellen, um nennenswerte Rezeptorspiegel zu exprimieren und zu erhalten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Expression von funktionellen antigenspezifischen TCRs auf T-Zellen der Maus durch Durchflusszytometrie zeigen. Hallo, mein Name ist Michelle Crow Guard.

Ich bin am NYU Cancer Institute an der NYU Medical School. Heute zeigen wir Ihnen, wie man primäre T-Zellen transduziert, die Leute, die Ihnen zeigen werden, wie man das macht, sind shiong, ein Postdoc im Labor, Kaleena Melek, eine Doktorandin im Labor, und Arian Perez Garcia, ein Postdoc im Labor. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie transgenen Mäusen besteht darin, dass sie viel weniger Zeit in Anspruch nimmt.

Diese Methode kann helfen, wichtige immunologische Fragen zu beantworten, z. B. welche TCR eine bessere Reaktion gegen Antigene geben kann. Diese Technik kann für die adoptive T-Zell-Transfer-Therapie angewendet werden, die sich als vielversprechend für die Behandlung von Krebspatienten erwiesen hat und in der In-vitro-Modifikation menschlicher T-Zellen besteht, um eine gleichmäßige Expression der T-Zell-Rezeptor-Alpha- und Beta-Ketten zu gewährleisten. Subklonen Sie das interessierende Gen unter der Kontrolle desselben Promotors in denselben retroviralen Vektor.

Bereiten Sie hochwertige Plasma-DNA mit dem Kyogen Maxi Vorbereitungskit vor und stellen Sie eine Brühe von einem Mikrogramm pro Mikroliter her. Entfernen Sie das Medium mit retroviralen Verpackungszellen aus Platin E von der Platte und waschen Sie die Platte einmal mit einem XPBS. Verdrängen Sie die Zellen durch Zugabe von Trypsin-EDTA und inkubieren Sie einige Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Neutralisieren Sie die gelösten Zellen mit DMEM-Medien und geben Sie sie in ein Falkenröhrchen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 1000 mal G. Aspirieren Sie das Supinat und resuspendieren Sie das Zellpellet in DMEM-Medien.

Bestimmen Sie die Zellzahl und verdünnen Sie die Zellen bei 0,6 mal 10 bis sechs pro Milliliter Platte. 10 Milliliter Zellsuspension in eine 10 Millimeter Polylysin beschichtete Gewebekulturplatte und wachsen Sie über Nacht in einem Zellinkubator bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid. Am nächsten Morgen untersuchen Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop, um eine flüssige Flüssigkeit von etwa 80 % zu überprüfen.

Entfernen Sie das Medium vorsichtig von der Platte. Waschen Sie die Zellen einmal mit einem XPBS und fügen Sie 10 Milliliter vorgewärmtes frisches DMEM-Medium ohne Penicillin oder Streptomycin hinzu. Für den Lippen-Mean-Transfektionskomplex werden zwei Mischungen hergestellt und opti ME M1 der DNA und die andere des Lipektomie-Reagenzes fünf Minuten lang bei Raumtemperatur getrennt ausgeglichen.

Dann vorsichtig vermischen und 20 Minuten inkubieren. Bei Raumtemperatur tropfen Sie die Mischung langsam in die Platin-E-Zellen. Schütteln Sie die Platte vorsichtig hin und her, um die Transfektionsmischung gleichmäßig zu verteilen.

Dann inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einem Zellinkubator. Ersetzen Sie das Medium nach sechs bis acht Stunden durch 10 Milliliter frisches DMEM-Medium für die Virusproduktion. Entnehmen Sie eine Mausmilz und übertragen Sie sie auf das RPMI-Medium.

Lege die Milz in ein Zellsieb. Zerdrücken Sie die Milz mit einem Spritzenkolben in eine fünf Zentimeter große Gewebekulturplatte. Spülen Sie die Zellen mit sterilem PBS aus dem Zellsieb, um die Zellen zu ernten, und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 1000-fachem G.

Verwerfen Sie den Suppen. Fahren Sie fort, indem Sie das Zellpellet in einem CK-Lysingpuffer suspendieren. Fügen Sie zwei Milliliter pro Milz hinzu und inkubieren Sie zwei Minuten lang.

Bei Raumtemperatur. Geben Sie RPMI-Medium bis zu 20 Milliliter hinzu und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 1000-fachem G. Zum Schluss resuspendieren Sie das Zellpellet in sterilem PBS.

Bestimmen Sie die Zellzahl und zentrifugieren Sie bei 1000 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Um die T-Zellen der Maus vor der viralen Transduktion zu aktivieren, überziehen die Platten mit aktivierenden Antikörpern, nämlich anti CD drei epsilon und anti CD 28. Bereiten Sie eine Antikörpermischung aus einem Mikrogramm pro Milliliter Anti-CD, drei Epsilon und zwei Mikrogramm pro Milliliter Anti-CD 28 in sterilem PBS vor, geben Sie 250 Mikroliter des Antikörpergemisches in jede Vertiefung der 24-Well-Gewebekulturplatte und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Beschriften Sie die Milzzellen magnetisch gemäß dem Produkthandbuch. Platzieren Sie eine LS-Säule in das Magnetfeld. Tragen Sie die beschriftete Zellsuspension auf die Säule auf.

Sammeln Sie den Durchfluss von angereicherten Maus-CD acht plus T-Zellen. Waschen Sie die Säule dreimal mit drei Millilitern Puffer und kombinieren Sie sie mit dem vorherigen Durchblasen. Färben Sie die Zellen mit anti CD drei Epsilon und anti CD acht alpha Antikörpern und analysieren Sie die Durchflusszytometrie.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 1000 mal G und resuspendieren Sie die Zellelle auf 1 Million Zellen pro Milliliter in RPMI-Medium mit rekombinantem humanem IL zwei. Entfernen Sie die Antikörperlösung von der Aktivierungsplatte. Spülen Sie jedes gut mit sterilem PBS aus.

Geben Sie einen Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte auf 37 Grad Celsius. 5% Kohlendioxid in einem Zellinkubator. Nach zwei Tagen Virusproduktion sollte das Medium in der Platin-ESE-Zellplatte gelb werden.

Übertragen Sie das virale Supinat in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, um Zelltrümmer zu entfernen. Zentrifugieren Sie den Virus-S-Überstand fünf Minuten lang bei 1000-fachem G. Übertragen Sie das Virussupinat vorsichtig in ein neues Röhrchen.

Lassen Sie etwas Flüssigkeit am Boden des Röhrchens und stören Sie die Zelltrümmer nicht. Sammeln Sie aktivierte T-Zellen von der Platte in einem konischen 50-Millimeter-Röhrchen. Ermitteln Sie die Zellennummer.

Bewahren Sie einige Zellen in einem separaten Röhrchen auf, um sie als Negativkontrollzentrifuge bei 1000-fachem G für fünf Minuten zu verwenden, und entsorgen Sie die Rückenlage. Dann resuspendieren Sie das Zellpellet in Virus-Rückenlage. Natant bei 10 bis sechs Zellen pro Milliliter mit 20 Nanogramm pro Milliliter rekombinantem Menschen, Interleukin zwei und 10 Mikrogramm pro Milliliter Proteinsulfat

Geben Sie einen Milliliter Zellsuspension in jede Vertiefung der 24-Well-Platte für das Kontrollröhrchen. Wiederbelebung. Suspendieren Sie die Zellen in RPMI-Medium bei gleicher Zelldichte mit der gleichen Menge an rekombinantem humanen, Interleukin zwei und Proteinsulfat. Fügen Sie die Zellen auf dieselbe Platte hinzu.

Wickeln Sie die Platte 90 Minuten lang bei 2000 mal G bei 32 Grad Celsius ohne Pause mit einer Zentrifuge aus Kunststofffolie ein. Entfernen Sie nach der Zentrifugation die Kunststofffolie. Fügen Sie jeweils einen Milliliter frisches RPMI-Medium mit 20 Nanogramm pro Milliliter rekombinantem humanem Interleukin hinzu und legen Sie die Platte wieder in den Inkubator.

Es ist wichtig, die transduzierten T-Zellen täglich zu untersuchen. Teilen Sie die Zellen bei Bedarf in einem bis drei Verhältnissen. Lassen Sie die Zellen nicht überwachsen oder lassen Sie das Medium am sechsten oder siebten Tag gelb werden.

Färben Sie die Zellen mit Antikörpern und MHC-Tetrameren, die spezifisch für den TCR sind, um die Expression von TCR auf der T-Zelloberfläche zu bewerten. Verwenden Sie die UNSD-T-Zellen als Kontrolle. Diese transduzierten T-Zellen sind nun bereit für weitere nachgelagerte Anwendungen.

Vor der viralen Transduktion. Es ist vorteilhaft, hochreine T-Zell-Untergruppen mit kommerziellen magnetischen Beads zu erhalten, um das Expressionsniveau von TCRs auf T-Zellen zu bewerten. Es können Antikörper verwendet werden, die spezifisch für TCR-Alpha- oder Beta-Ketten sind.

Typischerweise können 30 % bis 80 % der Zellen transduzierte TCR exprimieren, abhängig von den TCR-Genen und Virustitern. MHC-Tetramer, das spezifisch für den TCR ist, kann auch verwendet werden, um die funktionelle Expression von TCRs weiter zu verifizieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen nach diesem Verfahren in einem gesunden Zustand zu halten. Andere Methoden wie Zytotoxizitäts-, Säure- oder Zytokinfreisetzungsassays können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Spezifität und die Sensitivität von transduc zu beantworten. Die TCRs.

Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein Experte darin sein, Ihren Lieblings-TCR in primäre T-Zellen zu übertragen. Wir sehen uns also im Labor.