Mikroinjektion von Bakterien in die Schwanzvene von Zebrafisch-Embryonen

Nehmen Sie frühe Zebrafischembryonen, die im Fischwasser schweben, und entfernen Sie das Chorion, die schützende Membran, die die Embryonen umgibt.

Bringen Sie die Embryonen in eine V-förmige Positionierungskammer, die mit Fischwasser gefüllt ist, das ein Anästhetikum enthält, um sie für die Mikroinjektion zu immobilisieren.

Positioniere die Embryonen in der Kammer.

Als Nächstes wird eine homogene Suspension fluoreszierend markierter pathogener Bakterien in einem Puffer mit Reinigungsmitteln verdünnt, um bakterielle Klumpungen zu minimieren.

Fügen Sie einen Tracer-Farbstoff hinzu, um die Überwachung der Injektion zu erleichtern.

Laden Sie die Federung in eine Mikroinjektionsnadel, montieren Sie die Nadel auf einen Mikromanipulator und brechen Sie die Spitze, um eine kleine Öffnung zu schaffen.

Positionieren Sie den Embryo so, dass die ventrale Seite zur Nadel zeigt, und bringen Sie die Nadelspitze in die Nähe der urogenitalen Öffnung.

Führen Sie die Spitze vorsichtig in die Kaudalvene ein und injizieren Sie die bakterielle Suspension.

Transferiere die Embryonen auf eine Mehrfachbrunnenplatte mit Fischwasser für spätere Wirt-Bakterien-Interaktionsstudien.

Um Mikroinjektion von M durchzuführen. Abszess etwa 24 Stunden nach der Befruchtung oder HPF verwenden Sie eine Pinzette, um die Embryonen in einer 100-Millimeter-Petrischale zu dechorionieren und bei 28,5 Grad Celsius zu halten.

Übertragen Sie 30–48 HPF-Embryonen in eine V-förmige Positionierungskammer, die mit 25 Millilitern Fischwasser gefüllt ist, die 270 Milligramm pro Liter Trikain enthält. Mit einer abgeschnittenen Microloader-Spitze werden die Embryonen richtig in die Kanäle gelegt, um die Mikromanipulation zu erleichtern.

Verwenden Sie PBST mit 0,05 % Tween 80, um das mikrobakterielle Inokulum auf die gewünschte CFU zu verdünnen, und fügen Sie 10 % Phenolrot hinzu, um die korrekte Injektion zu überprüfen. Mit der Spitze eines Microloaders wird eine Mikroinjektionsnadel mit 5 bis 10 Mikrolitern des bakteriellen Inokulums geladen.

Schließen Sie die Mikroinjektionsnadel in den Halter eines Mikromanipulators an, der mit dem Injektor verbunden ist, und verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Oberseite der Nadel abzubrechen, um einen Öffnungsdurchmesser von 5 bis 10 Mikrometern zu erreichen.

Kalibrieren Sie das Einspritzvolumen, indem Sie den Mikroinjektionsdruck und -zeit anpassen. Um das erforderliche Injektionsvolumen zu erhalten, misst man dann den Durchmesser eines Tropfens, der in das Eigelb eines Embryos ausgestoßen wird.

Um Mikroinjizierungen in die Schwanzvene zu geben, positionieren Sie den Embryo so, dass die ventrale Seite zur Nadel zeigt, und die Nadelspitze nahe an die urogenitale Öffnung zu setzen, wobei Sie die Nadelspitze vorsichtig in den Embryo drücken, bis sie gerade den Schwanzvenenbereich durchsticht.

Anschließend wird das gewünschte Volumen bakterieller Suspension abgegeben, üblicherweise 1 bis 3 Nanoliter mit etwa 100 CFUs pro Nanoliter. Inkubieren und überwachen Sie die Embryonen gemäß dem Textprotokoll.