Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

Die folgende histologische Technik zur Herstellung von Paraffin-eingebetteten und gefrorenen Schnitten von Drosophila-Brustmuskeln ermöglicht eine effektive Analyse der Muskelmorphe und der Proteinausprägung. Dies wird erreicht, indem die Tiere zuerst in Kollarien fixiert und anschließend das Gewebe eingebettet wird. In Paraffin oder OCT-Medium werden die eingebetteten Ophthaxe mit dem Mikrotom geschnitten.

Schließlich werden die Schnitte gefärbt, um Muskelgewebestrukturen sichtbar zu machen oder unterschiedliche molekulare Bestandteile der Muskulatur nachzuweisen. Die resultierenden Präparate können in Kombination mit klassischen histologischen Färbemethoden, fluoreszierenden Farbstoffen oder Immunfärbungen die Morphologie des Muskelgewebes sowie die Lokalisation muskelspezifischer Komponenten darstellen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Möglichkeit, dünne Muskelstränge in ihrer natürlichen Anordnung innerhalb des Tieres zu erhalten.

Diese Methode kann leicht an andere Systeme angepasst werden, beispielsweise den Kopf-Abdomen-Bereich von Drosophila. Sie wurde im Labor von Helena Sheta, dem Labor für Genexpression und Signaltransduktion, entwickelt und wird heute von Maria Rinko demonstriert. Stellen Sie alle Lösungen zum Eintauchen der Kragen in Glasfärbegläsern bereit.

Stellen Sie frischen Carnoy-Fixans her, indem Sie absolutes Ethanol, Chloroform und Essigsäure in den Proportionen sechs zu drei zu eins mischen. Erstellen Sie einen Stapel aus Aluminiumfolie, mit Aussparungen in der richtigen Größe für die Kragen. Bereiten Sie außerdem die Ethanol-, Methanol- und Paraffinlösungen in Färbegefäßen vor.

Stellen Sie nun die Behälter mit Benzoesäuremethylester und Paraffin in einen Inkubator, der auf 60 bis 65 Grad Celsius eingestellt ist. Zusätzlich erwärmen Sie weiteres Paraffin auf 60 bis 65 Grad Celsius. Um in Folientaschen zu gießen, befestigen Sie den Kragen unter dem Mikroskop mithilfe von Klebeband in senkrechter Position, sodass die Einstiegstelle für die Fliege sichtbar ist.

Betäuben Sie die Fliegen entweder mit Kohlendioxid oder durch Hypothermie mithilfe eines Eisblocks. Achten Sie darauf, die Fliegen nicht mit einer Pinzette einzufrieren. Heben Sie einzelne Fliegen an den Flügeln auf und platzieren Sie jede Fliege so in der Halterung, dass ihr Kopf und Thorax oberhalb der Klingen liegen und ihr Abdomen unterhalb der Klingen ist.

Platzieren Sie 10 bis 20 Fliegen pro Kragen, wenn mehrere Genotypen analysiert werden. Notieren Sie die Kragennnummer und den entsprechenden Genotyp. Überführen Sie den Kragen in Carnoys Lösung und fixieren Sie das Gewebe über Nacht bei vier Grad Celsius.

Nach der Fixierung das Probenmaterial dehydrieren, indem der Kragen nacheinander für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur in Ethanolbädern steigender Konzentration getaucht wird. Anschließend den Kragen jeweils 30 Minuten in Benzoesäuremethylester und in einer Mischung aus Benzoesäuremethylester und Paraffin inkubieren und danach den Kragen zweimal für jeweils 60 Minuten in frischem Paraffin infiltrieren. Den Kragen bei 60 bis 65 Grad Celsius rasch in eine Folientasche überführen.

Zu diesem Zeitpunkt sollte der Kragen in den Folientaschen positioniert werden, um die Orientierung der Schnitte in longitudinaler oder transversaler Richtung zu erleichtern. Anschließend die Taschen mit geschmolzenem Paraffin füllen, damit das Paraffin erstarren kann. Die Folientaschen über Nacht bei Raumtemperatur stehen lassen.

Entfernen Sie die trockenen Paraffinblöcke mit Kragen vorsichtig aus der Folie und lösen Sie den Kragen mit Hilfe eines scharfen Skalpells vorsichtig vom Paraffinblock. Meißeln Sie am Rotationsmikrotom vorsichtig das überschüssige Paraffin um das Fliegengewebe herum weg. Schneiden Sie den Paraffinblock in Schnitten von sieben bis zehn Mikrometern Dicke.

Lassen Sie das geschnittene Gewebe flach in einem Wasserbad mit 30 Grad Celsius schwimmen. Legen Sie das Gewebeschnittpräparat schließlich auf Polarisationsobjektträger und trocknen Sie es über Nacht. Diese Objektträger sind nun bereit für die Färbung mit Hämatin und Eosin.

Eine Stunde vor Beginn des Experiments die Flasche mit dem Kryo-Einbettmedium kopfüber in einen Kühlschrank mit vier Grad Celsius stellen, um es abzukühlen und die Bildung von Luftblasen zu minimieren. Zusätzlich einen Gefrierkühler mit minus 60 Grad Celsius mithilfe von Ethanol und Trockeneis vorbereiten. Wie bei Paraffinschnitten fixieren Sie die Fliegen in einem Kragen, übertragen den Kragen mit den Fliegen in eine vorgekühlte Folientasche und füllen diese schnell mit OCT, der Kryo-Einbettmasse.

Lassen Sie das OCT aushärten. Entfernen Sie vorsichtig die Folie von dem gebildeten Block innerhalb des Kühlbehälters. Lösen Sie sanft den Ring vom Einbettungsblock und lagern Sie ihn mindestens einen Tag lang bei minus 20 Grad Celsius. Schneiden Sie die gefrorenen Muskeln an einem Kryostaten zwischen minus 15 und minus 18 Grad Celsius mit einer Schnittdicke von 10 bis 15 Mikrometern.

Danach die Proben auf polarisierte Objektträger geben. Die Proben bei minus 20 Grad Celsius lagern, bis sie für die weitere Verarbeitung bereit sind. Lipid-Ausfälle können mit Oil-Red-O-Färbung an Kryoschnitten nachgewiesen werden.

Mithilfe eines Protokolls, das von Seber und Tum übernommen wurde, beachten Sie, dass die gefrorenen Schnitte unmittelbar vor der Färbung 10 Minuten lang in 4 % Formaldehyd fixiert werden müssen. Anschließend die Objektträger zweimal für jeweils fünf Minuten mit Wasser waschen. Danach 10 Minuten in Propylenglykol äquilibrieren.

Jetzt drei Stunden im Öl inkubieren. Rot-O-Färbung bei Raumtemperatur durchführen. Anschließend die Proben zweimal je fünf Minuten in Polypropylenglykol waschen, gefolgt von 30 Minuten in PBS. Die Proben in 30 % Glycerol einbetten und mit Hämatoxylin und Eosin färben. Querschnitte und Längsschnitte der indirekten Flugmuskeln untersuchen, um abweichende Größe und Morphologie von normal strukturierten Muskeln zu differenzieren.

Paraffin-eingebettete Schnitte können ebenfalls effektiv mit Antikörpern gefärbt werden, wie in diesem Abschnitt des Drosophila-Darmtrakts gezeigt, der für den Kernhüllen-Marker Lamin C und die Kernfärbung DPI beleuchtet ist. Hier wurden Querschnitte des Drosophila-Thorax mit Anti-Lamin C und DPI gefärbt, um eine vergrößerte Ansicht normaler und degenerierter Muskulatur darzustellen.

Ebenso können longitudinale Gefrierschnitte indirekter Flugmuskeln mit Anti-distro, Glykan-Muskel- und Sarkolemmamarker sowie DPI gefärbt werden, während transversale Gefrierschnitte des Drosophila-Thorax mit Oil Red O Lipidtröpfchen markieren. Eine Kombination dieser Techniken mit anderen Methoden wie HNE-Färbung und immunhistochematischer Detektion bietet einen leistungsfähigen Ansatz, um die Gewebestruktur und die Proteinlokalisation in Muskeln zu bestimmen.