Name: Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Erfahren Sie, wie die Kinetik der mRNA-Transkription in einzelnen lebenden Zellen mit FRAP und fluoreszenter Markierung gemessen wird. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Visualisierung der RNA-Polymerase-II-Aktivität.

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YS-T wird von der European Research Council (ERC), der Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Israel Cancer Research Fund (ICRF), Deutsch-Israelische Stiftung für Wissenschaftliche Forschung und Entwicklung (GIF unterstützt ), USA-Israel Binationale Science Foundation (BSF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP), und die israelischen Ministerien für Wissenschaft und Gesundheit und ist der Jane Stern Lebell Familie Fellow in Life Sciences an der Bar-Ilan University. YB ist dankbar für die Azrieli Stiftung für die Vergabe eines Stipendiums Azrieli.

Die Zelle verwendet wird, muss über ein integriertes Gen-Konstrukt, das MS2 Wiederholungssequenzen für das Tagging der mRNA in lebenden Zellen enthält. In diesem Protokoll verwenden wir eine menschliche U2OS Zelllinie Beherbergung eines stabil integrierten β-Aktin-Gen, also Fluoreszenz an der DNA, RNA und Protein-Ebene 8 ist markiert, wie folgt (Abbildung 1A): Die 5 'des Gens lac-Operator enthält ( lacO) wiederholt - diese werden verwendet, um das Gen (DNA)-Tag und damit zu identifizieren den genomischen Locus der Integration. Ein fluoreszierend markierten lac-Repressor-Protein (AVIG) wird dem lacO wiederholt binden und Tag der DNA. Die mRNAs werden mit YFP-MS2 Proteine, die an die MS2 Wiederholungen (Stem-Loops) zu binden, markiert. Das Genprodukt ist CFP-Aktin und damit die Induktion des Gens wird in das Erscheinungsbild der GFP-markierten Aktin-Zytoskeletts führen. Das Gen-Konstrukt wird in eine U2OS Tet-On stabile Zelllinie transfiziert und seinen Ausdruck unter Tet transkriptionelle Kontrolle. 1. Zell-Beschichtung und Transfektion: <ol><li> 48 Stunden vor den Messungen, Saatgut ~ 2 * 10 5 Zellen auf Glasboden Gewebekulturschalen (35 mm Petrischalen mit einem 14 mm Glasboden-Mikrotiterplatten (0,16 bis 0,19 mm Dicke;. Kat.-Nr. P35G-1,5-14-C , MatTek, Ashland, MA)). Add 2 ml Medium zu den Zellen, um 50-80% Konfluenz erreichen. </li><li> 24 Stunden vor dem Versuch, transient transfizieren die Zellen mit Konstrukten, dass die fluoreszierenden Marker zur Markierung der DNA und der mRNA zum Ausdruck bringen. Verwenden Sie Fugene6 Transfektionsreagenz (Roche). Die Konstrukte verwendet: <ol type="a"><li> YFP-MS2-NLS wird der MS2 Stem-Loops in der mRNA-Transkripte Tag. Die Kernlokalisierungssequenz (NLS) bietet die nukleare Eintrag Sequenz für das YFP-MS2 Protein. </li><li> optional - CFP-LacI oder RFP-LacI, dass die lacO wiederholt in der 5 'des Gens bindet und das Gen-Locus-Label. Tagging der Genlocus hilft bei der Verfolgung des Gens während der FRAP-Experiment ist aber nicht notwendig. </li></ol></li><li> Inkubieren Sie die Zellen für mindestens 12 Stunden, um eine gute Ausdruck der transient transfizierten Proteinen (siehe Anmerkung) zu erhalten. </li><li> 6 bis 12 Stunden vor dem Versuch add 1,5 ug / ml Doxycyclin (Sigma) zu den Zellen zur Aktivierung des Tet-induzierbare GFP-Aktin-Gen. </li></ol> Notes: * Es ist wichtig, nicht zu sehr hohen Expression der transfizierten Proteine ​​zu erreichen, um nicht das Signal gezielt aus der Transkription Ort, bezogen auf das Hintergrund-Signal erhalten Maske. B) Änderung der Stärke der Promotor (zB CMV ist stärker als die L30-Promotor), c) Zugabe eines nuklearen Export Signal (NES), die a) die Anpassung der Zeit zwischen Transfektion und das Experiment: Ebenen des Ausdrucks kann kontrolliert werden durch YFP-MS2-NLS-Protein, das hilft verteilen die YFP-Signal in die ganze Zelle. * Der Fluorophor für die Messungen verwendet sollte vorzugsweise über lange Akquisitionen photostabil, daher grün / gelb emittierenden Fluorophore sind besser als rote Fluorophore. Informationen zu den verschiedenen Fluorophore können in Lit. 10 zu finden. * Bestimmen Sie, dass die unterschiedlichen Licht-Kanäle nicht Durchschlagen zueinander. Verwenden Sie Folien mit Mustern mit jeder der Marker separat beschriftet, in jeder Folie messen die Intensität der beiden Kanäle, und berechnen dann die Durchschlagen. 2. FRAP: Das Experiment kann auf jedem Mikroskop, das in der Lage sowohl den Erwerb von Bildern und Durchführung Bleichen mit einem Laserstrahl durchgeführt werden. Typischerweise sind FRAP Experimente mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) durchgeführt. Da jedoch in unserem Fall das Experiment relativ lange (15-30 min) ist, und wir sind nach einem kleinen Ort innerhalb des Zellkerns, ist es wichtig, dass die Gen-Locus / Transkription vor Ort im Fokus zu halten während des gesamten Experiments. Dies erfordert eine schnelle Bildgebung in 3 Dimensionen über die Zeit (4D), und ein solcher Erwerb Preise sind schwer zu bekommen mit einem konfokalen Mikroskop. Deshalb verwenden wir eine 3D-FRAP-System (Photometrics) auf einem wide-field Olympus IX81 Mikroskop (63X Plan-Apo, 1,4 NA) mit einem EM-CCD (Quant-EM, Roper) ausgestattet, das Bilder mit hoher Geschwindigkeit zu erwerben gebaut (bis zu 30 Bilder / sec). Das System verfügt über 405 nm und 491 nm Laser, die mit der Kamera zu aktivieren Bleichen auf eine bestimmte Region of Interest (ROI) der Probe synchronisiert werden können. Das Mikroskop ist mit einem Lambda DG-4 Lichtquelle (Sutter) und ein XY &amp; Z Stufe (Prior), die schnelle und genaue Bildgebung in der Z-Achse ermöglicht. Alle Geräte sind integriert und werden von MetaMorph (Molecular Devices). Die Live-cell Experimente sind bei 37 ° C mit 5% CO 2 mit einem lebenden Zellen-Kammer-System (Tokai). <ol><li> Vorgehensweise: Eine halbe Stunde vor dem Versuch, auf dem Heizgerät, Mikroskop und Laser einzuschalten. Während der Experimentement die Temperatur muss konstant bleiben, da es sonst Fokus ändert sich während der langen Messzeiten führen. Laserleistung muss für konsistente Leistung stabil. </li><li> Synchronisieren Sie den Laser mit der Kamera: <ol><li> Suche nach einem Gebiet in der Platte, das keine Zellen (DIC). </li><li> Verwenden Sie die gleiche Licht-Kanal, der für die Experimente verwendet werden. Hier verwenden wir die 491 nm-Laser für die YFP-Kanal. </li><li> Richten Sie die Laser auf die Mitte des Bildes. </li><li> Verwenden Sie die Schaltfläche Synchronisieren (vorausgesetzt, Makro). </li><li> Probieren Sie verschiedene Stellen in das Feld, um sicherzustellen, dass die Laser und Kamera synchronisiert werden. </li></ol></li><li> Wählen Sie ein guter Kandidat Zelle für das Experiment. Obwohl wir mit stabilen Zelllinien arbeiten, finden wir, dass nicht alle Zellen ähnliche Expression haben. Gute Kandidaten wären Zellen sein, dass: a) zeigen einen klaren YFP-MS2-tagged Transkription Lage, oberhalb der diffuse YFP-MS2 Hintergrund, und b) über genügend freien YFP-MS2 Proteins in der Zelle, um so in der Lage sein, wieder ganz gesund, nachdem die Bleichen (Beispiel in Abbildung 1B - vergleichen Sie die beiden Zellen, die linke Zelle ist nicht ein guter Kandidat für das Bleichen). </li><li> Wählen Sie geeignete Messbedingungen. Die FRAP Verfahren erfordert den Erwerb von vielen Bildern, und deshalb ist es wichtig, zwischen vernünftigen Belichtungszeiten und mit wie wenig Licht wie möglich auszugleichen. Hohe Lichtverhältnissen kann sich auf die Zelle aufgrund Phototoxizität und verursachen Ausbleichen. Es wird empfohlen, halten bildgebenden Parameter konstant zwischen verschiedenen Experimenten. Die Zellen werden in der YFP-Kanal mit 150 msec Belichtungszeiten abgebildet und in der GFP-Kanal für die Detektion von GFP-lacI (genomischen Locus). Nach dem CFP-LacI getaggt locus erlaubt den Nachweis des Gens, selbst wenn die YFP-MS2 mRNA-Signal wird gebleicht (optional). Für jeden Kauf, 7 Z-Scheiben sind alle 350 nm aufgenommen. Die aktive Transkription Website wird gebleicht mit der 491 nm-Laser. </li><li> Führen Sie die vollständigen Experiment aber ohne Bleichen. Die FRAP-Experiment misst die Zeit, die für die Transkription Seite, um steady state zurückzukehren. Zuerst wollen wir sicherstellen, dass die aktive Transkription site funktionelles und stabiles in einem stabilen Zustand ist. Deshalb führen wir eine komplette FRAP-Experiment aber ohne Bleichen, um sicherzustellen, dass die gemessene Intensität der Transkription Website nicht während des Experiments Zeitrahmen ändern. Wir verwenden dieses Experiment auch testen unsere Imaging-Bedingungen durch Messung der insgesamt Ausbleichen durch die vollständige Abbildung Reihen. Als Faustregel gilt, sollte sich den ganzen Film photobleach nicht mehr als 30% der ursprünglichen Intensität. Dies kann durch das Intensitätsverhältnis der gleichen Stelle in den Zellkern aus dem letzten Bild, um erste Bild (Verhältnis sollte größer sein als 0,7) unterteilt gemessen werden. </li><li> FRAP: Die YFP-MS2-Signal an das aktive Transkription Website wird gebleicht mit der 491 nm-Laser. 6 voreingestellte Bleichmittel Bilder erworben werden. Post-Bleiche Bilder werden in einer Folge von 3 mal Frequenzen erworben: 15 Bilder alle 3 Sek., 15 Bilder alle 6 sec, und 26 (bzw. 45 für lange Experimente) Bilder alle 30 Sekunden. Die Veränderungen in der Häufigkeit des Erwerbs von Bildern ermöglicht es, mehr Bilder, die während der Zeit, dass die höchste Intensität zu ändern (anfänglicher Besserung), und weniger Bilder gegen Ende zeigen, wenn die Änderungen in der Signalstärke weniger prominent sind zu erwerben. </li></ol> Hinweise: Dieses Experiment unterscheidet sich von "normalen" FRAP, dass: * FRAP der mRNA an der Transkription site Maßnahmen die Bindung von YFP-MS2 Proteine, die im Entstehen begriffenen mRNA, während typische FRAP Experimenten messen die Mobilität der verschiedenen Proteine ​​in der Zelle. Deshalb gibt es kein Interesse an der Messung der diffusive Pool von YFP-MS2 Proteine. Wenn die Zeit zwischen Bleich-und der ersten aufgenommenen Bildes relativ lange ist es möglich, diese diffundieren Pool der freien YFP-MS2 Proteine ​​zu ignorieren. * Da die Erholung der YFP-MS2 Signal ist relativ lang (15-30 min), ist es wichtig, die Transkription Ort im Fokus zu behalten. Deshalb ist eine Reihe von Z-Scheiben zu jedem Zeitpunkt erworben wird. 3. Die Normalisierung der FRAP Daten: Die 4D FRAP Daten werden analysiert mit dem kostenlosen Bild-Analyse-Software ImageJ (NIH, Bethesda, MD; <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). Nach Ist-Analyse mit Makros zur Verfügung über die ImageJ-Software durchgeführt, aber natürlich selbst geschriebenen Makros generiert werden können. <ol><li> Z-Stapel maximal zu jeder Zeit-Punkt projiziert, was zu einem 2D-Film über die Zeit für die weitere Analyse. </li><li> Die Transkription Website wird in jedem Frame verfolgt und die mittlere Intensität wird mit dem Spot Tracker-Tool. 11 Die Daten in eine Excel-Tabelle zur weiteren Analyse gespeichert werden. </li><li> Für jeden Zeit-Punkt, sind die mittleren Intensitäten bei anderen regions of interest (ROI) wie folgt (mit Hilfe der Time Series Analyzer Plug-in von ImageJ) gemessen: a) Der RückenBoden ist von einem ROI außerhalb der Zelle = B (t) genommen. b) Ein ROI im Zellkern, sondern so weit wie möglich aus der Bleiche site = C (t). c) Die Transkription site = S (t) (wie von der Stelle Tracker gemessen). </li><li> Korrigieren Sie die Daten für Ausbleichen während der Bildgebung verursacht: Subtrahieren dem Hintergrund von allen anderen Messungen und korrigieren Sie dann das Bleichmittel. Sc (t) ist die korrigierte Intensität der Transkription Ort zum Zeitpunkt t. </li></ol> eq. 1: <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq1.jpg" alt="Gleichung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 1"><ol start="5"><li> Normalisieren der Daten: erste Berechnung des Durchschnitts der pre-Bleiche Bilder, die die Intensität der Transkription Seite zeigt im Steady-State (= &lt;Sc (pre-bleach)&gt;). </li></ol> Dann normalisieren die Daten: eq. 2 <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq2.jpg" alt="Gleichung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 2"> Die Daten werden für mindestens 10 Versuche normalisiert. Berechnen Sie den Durchschnitt der Experimente und die Standardabweichung (STD) für die Fehler-Bars zu jeder Zeit-Punkt (Abbildung 1C). Notes: Die Diffusion des YFP-MS2 Protein während der FRAP-Analyse wurde seit der Diffusionsgeschwindigkeit der freien nukleoplasmatischen YFP-MS2 ist sehr schnell außer Acht gelassen, während das gebundene YFP-MS2 mit hoher Affinität an die mRNA verknüpft ist, und nicht, um die Transkription wieder anbringen site. Deshalb ist das erste Bild nach dem Bleichen vor der Analyse entfernt werden sollte. 4. Die Analyse der Daten mit Hilfe eines mathematischen Modells: Um die kinetischen Parameter aus dieser Art von Daten abzurufen, haben wir die einfachste beschriebenen Modell, das diese Art von Daten passen. Die vollständige Erklärung für dieses spezifische Modell kann hier 5 gelesen werden. Das Modell enthält die folgenden Gleichungen, dass die Regelung beschreiben in Abbildung 2a: <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq3.jpg" alt="Gleichung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 3"> <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq4.jpg" alt="Gleichung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 4"> Nachdem die Modellparameter, ist es möglich, die Dehnung zu berechnen: <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq5.jpg" alt="Gleichung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 5"> Wir analysierten die Kurve mit Berkeley Madonna ( <a href="http://www.berkeleymadonna.com">http://www.berkeleymadonna.com</a> ), wie bisher 5 modelliert, sondern auch andere Optionen zur Verfügung (MatLab, Virtual Cell, COPASI etc.). Die Daten wurden auf das Modell passen und Geschwindigkeitskonstanten wurden extrahiert. Wir legen den Code in Berkeley Madonna. Um eine optimale Passform der Daten berechneten wir die stationäre und dann passen die normierten experimentellen Daten auf den normalisierten Modell. 5. Repräsentative Ergebnisse: Wir gebleicht markierten mRNA-Signal an das aktive Transkription Ort mit hoher Laserleistung und folgte der Erholung der YFP-MS2-Signals über die Zeit. Das Fluoreszenzsignal bei der Transkription Ort besteht aus den steady state Kinetik der mRNA-Synthese sowie mRNA von der Website veröffentlicht. Mess-Transkription site Intensität im Laufe der Zeit ohne Bleichen gibt eine "konstante"-Signal (Abbildung 1c, die roten Punkte), dass dieses Gen derzeit in einer relativ stabilen Zustand impliziert. Dies bedeutet, dass das Signal, das auf dem neu transkribierten mRNA akkumuliert gleich das Signal, dass, wenn eine mRNA, die aus der Transkription Website veröffentlicht wird Blättern. Wenn gebleicht, setzt dieses System in seinen stationären Zustand, sondern ist nun möglich, die Zeit, die für das Signal sich zu erholen messen. Daher ist die Regeneration der Fluoreszenz hängt meistens von der Dehnbarkeit der Polymerase. Die 3D-FRAP-System erlaubt die Übernahme der vollständigen 3D-nuklearen Lautstärke während FRAP Erholung, und damit kein Signal wurde während der Experimente verloren. Für die Berechnung der kinetischen Parameter aus den Daten wurde die normierte Kurve, um die kinetische Modell zur Beschreibung Dehnung, die auf Differentialgleichungen ausgestattet ist. 5 Der Vorteil der Verwendung eines einfachen ODE-Modell ist, dass es nur eine kleine Anzahl von Parametern angepasst werden . Der erste Schritt des Modells (Einstiegspunkt) ist Dehnung, nämlich den Prozess verantwortlich für die Synthese von neuen MS2-Bindungsstellen. Das Ende Schritt (Ausgangspunkt) ist mRNA Freisetzung in die Kernplasma. Das Modell basiert auf der Recovery-Kurven, die von zwei kinetisch aufgelöst Komponenten bestehen, einer schnellen und einer langsameren basiert. Die schnelle Komponente bezieht sich auf Dehnung, während die langsamere Komponente als Polymerase Pause während der Dehnung modelliert wurde. Die beiden Polymerase Staaten wurden als Dehnung mit einem stochastischen Übergang zur Pause modelliert. Wir optimieren die Differentialgleichungen von diesem Modell, das eine Dehnung Geschwindigkeit von 3,3 kb / Minute mit einem stochastischen Übergang zu einem langsameren Synthese-Rate (Pause für eine kumulative Zeit von 2,5 Minuten) ergab. Modeling zeigte that dieser Übergang von der Dehnung zu pausieren betroffen nur 11% der Polymerasen, die Dehnung eingetragen. <table border="1"><tbody><tr><td> K aus </td><td> 0,0112 </td><td></td></tr><tr><td> K pause_in </td><td> 0,0015 </td><td></td></tr><tr><td> K pause_out </td><td> 0,0067 </td><td></td></tr><tr><td> Dehnung der Zeit </td><td> (K out + k pause_out) -1 </td><td> 56 Sek. </td></tr><tr><td> Pausenzeit </td><td> (K pause_out) -1 </td><td> 2,5 Minuten </td></tr><tr><td> Pause Wahrscheinlichkeit </td><td> (K pause_in) / (K + k pause_in out) </td><td> 11% </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Das Modell führt zu einer Parameter-Tabelle. <img src="/files/ftp_upload/2898/2898fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. (A) Die experimentellen Zellsystem für folgende Genexpression in vivo eingesetzt. Schematische Darstellung der GFP-Aktin-Gen zu konstruieren. Das 5'-Ende enthält eine Reihe von 256 lacO wiederholt, dass durch die RFP-LacI (rot) gebunden sind, und markieren Sie die Website von Gen-Integration. Transkriptionelle Induktion von der minimalen CMV-Promotor wird durch die Bindung von reverse Tetracyclin Transkriptionsaktivator (rtTA oder Tet-On), um Tet-responsive Elemente (tres) in Gegenwart von dox erreicht. Die transkribierte mRNA enthält die codierende Sequenz für GFP-β-Aktin und 24 MS2 wiederholt, dass durch die YFP-MS2-Fusionsprotein gebunden sind. Am 3'-Ende wird ein Teil eines Kaninchens β-Globin Exon-Intron-Exon-Modul durch eine Spaltung-polyA-Signal. Das Schema beschreibt auch die Dehnung Assay zeigt fluoreszierende Proteine ​​MS2 (gelb) an den neu transkribiert mRNAs durch RNA-Polymerase II transkribiert. (B) eine aktive Transkription Website (YFP-MS2, die rechte Hand Zelle) wurde gebleicht und die Fluoreszenz Erholung wurde verfolgt im Laufe der Zeit (Frames auf der Unterseite). Wir maßen die Fluoreszenzintensität beider Bleichmittel (mittlere Linie) und nicht-gebleichten (untere Zeile) aktiv Transkription Seiten. Beachten Sie die linke Zelle ist nicht für ein Ausbleichen Experiment geeignet. (C) Die experimentellen Messungen über die GFP-Aktin-Gen-Transkription Standorten durchgeführt. In blau die Erholung Kurven der YFP-MS2 FRAP-Messungen. In Rot, eine nicht-gebleichten Zelle aus dem gleichen Experiment zeigt die YFP-MS2-Signal an der Transkription site in einem stabilen Zustand. <img src="/files/ftp_upload/2898/2898fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. (A) Schema des Modells zur Beschreibung des Ein-und Ausfahrt Kinetik der mRNAs mit YFP-MS2-Moleküle bei der Transkription Ort markiert. (B) YFP-MS2 FRAP Daten und der angepassten Simulation (der Durchschnitt der zehn Experimente war es, das Modell eingebaut) . Die berechneten Residuen der fit werden am Ende präsentiert.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Methode zur Messung Polymerase kinetische Aktivität in lebenden Zellen lassen sich in zwei Teile aufgeteilt werden. Der erste Teil beschreibt die &quot;nassen&quot; Verfahren, das die Mess-und Abrufen der kinetischen Daten der mRNA Transkription ermöglicht, während im zweiten Teil, werden die Daten analysiert mit Hilfe eines ODE-Modell. 5 Eine Reihe von Studien haben nun diesen Ansatz zur Extraktion verwendet Transkription Kinetik in lebenden Zellen 5, 6, 8, 12-14. Der wesentliche Unterschied z...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th></tr><tr><td> Doxycyclin </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> FuGENE 6 Transfektionsreagenz </td><td> Roche </td></tr></tbody></table>

die messung der kinetik der mrna transkription in einzelnen lebenden zellen

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

Die transkriptionelle Aktivität der RNA-Polymerase II (Pol II) ist ein dynamischer Prozess und damit die Messung der Kinetik der Transkription in vivo von Bedeutung ist. Pol II Kinetik gemessen wurden mit biochemischen oder molekularbiologischen Methoden. In den letzten Jahren 1-3, mit der Entwicklung neuer Visualisierungs-Methoden ist es möglich geworden, um die Transkription zu folgen, wie es in Echtzeit geschieht in einzelnen lebenden Zellen. 4 hierin beschreiben wir, wie durchführen Analyse der Pol II Dehnung Kinetik auf ein bestimmtes Gen in lebenden Zellen. 5, 6 mit einer Zelllinie, in denen ein bestimmtes Gen-Locus (DNA), die mRNA Produkt, und die endgültige Protein-Produkt fluoreszenzmarkierten und visualisiert werden können in vivo , ist es möglich, die tatsächliche Übertragung der mRNAs auf dem Gen von Interesse zu erkennen. 7, 8 Die mRNA fluoreszierend markiert wird mit dem MS2-System für die Kennzeichnung mRNAs in vivo, in denen die 3&#39;UTR der mRNA-Transkripte enthalten 24 MS2 stem-loop wiederholt, die sehr spezifische Bindungsstellen für den YFP-MS2-Hüllprotein, dass die mRNA-Etiketten, wie sie transkribiert wird stellen. 9 Zur Überwachung der Kinetik der Transkription nutzen wir die Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)-Methode. Durch Bleichen des YFP-MS2-tagged entstehenden Transkripte an der Stelle der Transkription und dann nach der Erholung von diesem Signal im Laufe der Zeit haben wir die Synthese-Rate der neu gemacht mRNAs zu erhalten. 5 In anderen Worten, spiegelt YFP-MS2 Fluoreszenz Erholung der Erzeugung der neuen MS2 Stem-Loops in der aufkeimenden Transkripte und deren Bindung von fluoreszierenden freien YFP-MS2 Moleküle, aus den umliegenden Kernplasma. Die FRAP Erholung Kurven werden dann analysiert mit Hilfe mathematischer mechanistischen Modellen durch eine Reihe von Differentialgleichungen formalisiert, um die kinetische Zeitparameter der Transkription abzurufen.

RNA-Polymerase II Transkription Kinetik auf bestimmte Gene in lebenden Zellen gemessen. mRNAs aus dem Gen von Interesse transkribiert werden fluoreszenzmarkierten und mit Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der in vivo Kinetik von Transkriptions-Dehnung erhalten werden.

Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen

Die transkriptionelle Aktivität der RNA-Polymerase II (Pol II) ist ein dynamischer Prozess, weshalb die Messung der Kinetik des Transkriptionsprozesses in ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Transkriptionsdynamik der RNA-Polymerase II in lebenden Zellen in Echtzeit zu messen, während sie einen bestimmten Genabschnitt abliest. Um die Transkription einer spezifischen Gensequenz verfolgen zu können, wird ein Genkonstrukt stabil in eine humane Zelllinie integriert. Dieses Gen liegt in mehreren Kopien an einer zufälligen Stelle im Genom vor und bildet einen Genort, der ein Tandemarray dieses spezifischen Gens enthält.Wenn die Genexpression aktiviert wird, wird die RNA-Polymerase II zum Gen rekrutiert und bewegt sich entlang des DNA-Strangs in downstream-Richtung, wobei das mRNA-Molekül erzeugt wird, um die transkribierte mRNA zu markieren und nachzuweisen. Eine Reihe eindeutiger Sequenzen oder MS2-Wiederholungen, die als Bindungsstellen für ein fluoreszierendes Protein (YFP-MS2) dienen, wurde in die Gensequenz eingefügt. Die Geschwindigkeit, mit der die MS2-STEM-Schleifen gebildet werden, entspricht der Transkriptionsrate. Die Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleaching (FRAP) wird anschließend verwendet, um die laufende Transkription visuell nachzuweisen.Ein starker Laserstrahl wird auf die aktive Transkriptionsstelle gerichtet, um die YFP MS2-Moleküle auszubleichen, und die Wiederherstellung der Fluoreszenz wird verfolgt. Die Geschwindigkeit, mit der das Fluoreszenzsignal zurückkehrt, spiegelt die Geschwindigkeit wider, mit der RNA-Polymerase II transkribiert. Es wird eine Erholungskurve erhalten, die die Zunahme der YFP MS2-Intensität an der Transkriptionsstelle zeigt.Mit der Zeit können dann die transkriptionellen Kinetiken aus diesen Daten extrahiert werden. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Elongationsraten der RNA-Polymerase II in vivo gemessen werden können und dass diese deutlich schneller sind als frühere in-vitro-Messungen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie biochemischen Ansätzen besteht darin, dass wir hier Kinetiken innerhalb einer einzelnen lebenden Zelle an einem spezifischen Gen messen können.Mithilfe dieser Methoden lässt sich Einblick gewinnen in den grundlegendsten Prozess der mRNA-Transkription, der in jeder einzelnen Zelle unseres Körpers abläuft. Eine visuelle Demonstration dieser Methoden ist wichtig, da mehrere Schritte zu beachten sind. Wir experimentieren mit Zellen unter dem Mikroskop, und anschließend muss eine Datenanalyse mithilfe von Computer-Software erfolgen, um die Elongationskinetik der RNA-Polymerase II an einem bestimmten Gen in lebenden Zellen zu analysieren.Dieses Protokoll verwendet eine humane U2-OS-Zelllinie, in der ein stabil integriertes Beta-Aktin-Gen, sein mRNA-Produkt und das finale Proteinprodukt fluoreszenzmarkiert werden können. Hier ist eine schematische Darstellung des CFP-Beta-Aktin-Gen-Konstrukts, das in die U2-OS-Zellen integriert wurde. Die transkriptionelle Induktion vom minimalen CMV-Promotor wird durch die Bindung des reversen Tetracyclin-transkriptionellen Aktivators an tet-reaktive Elemente oder Tres in Gegenwart von Doxycyclin erreicht; die transkribierte mRNA enthält die Sequenz für die Markierung mit CFP-Beta-Aktin und 24 MS2-Wiederholungen, die durch das YFP-MS2-Fusionsprotein gebunden werden.Eine aktive Transkriptionsstelle erscheint gelb aufgrund der Bindung der beiden YFP-MS-Proteine. Das Aktin-Zytoskelett erscheint blau aufgrund des mit CFP markierten Aktins. 48 Stunden vor dem Fluoreszenz-Recycling-nach-Photobleaching- oder Frap-Experiment bereiten Sie die U2-OS-Zellen für die Transfektion vor, indem Sie etwa zwei mal 10 hoch fünf Zellen auf Glasboden-Kulturschalen ansäen und zwei Milliliter Medium zu den Zellen hinzufügen, um eine Konfluenz von 50 bis 80 % zu erreichen. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. 24 Stunden später, 24 Stunden vor dem Frap-Experiment, transfectieren Sie die Zellen transient mit einem YFP-MS2-Konstrukt, das den fluoreszierenden Marker zur Markierung der mRNA exprimiert. Der YFP-MS2-Konstrukt enthält eine Kernlokalisierungssequenz (NLS), die den Eintritt des YFP-MS2-Proteins in den Zellkern ermöglicht.Inkubieren Sie die Zellen mindestens 12 Stunden bei 37 Grad Celsius, um eine gute Expression der transient transfizierten Proteine zu erzielen. Sechs bis 12 Stunden vor dem Experiment Doxycyclin zu den Zellen hinzufügen, um das TED-induzierbare CFP-Aktin-Gen zu aktivieren, und die Zellen anschließend in den Inkubator bei 37 Grad Celsius zurückbringen. Da unser Experiment relativ lang ist und wir einen kleinen Locus innerhalb des Zellkerns verfolgen, ist es wichtig, die Transkriptionsstelle des Genlokus während des gesamten Experiments scharf im Fokus halten zu können.Dies erforderte eine schnelle dreidimensionale Abbildung über die Zeit. Daher verwenden wir ein 3D-FRA-System anstelle eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops. Eine halbe Stunde vor dem Live-Cell-Experiment schalten Sie die Heizvorrichtung, das Mikroskop und den Laser ein.Die Ausrüstung, die für diese Demonstration verwendet wird, ist ein 3D-FRAP-System, das auf einem Weitfeld-Olympus-IX-81-Mikroskop basiert und mit einer EM-CCD-Kamera ausgestattet ist, die Bilder mit hoher Geschwindigkeit von bis zu 30 Bildern pro Sekunde aufnehmen kann. Das Mikroskop verfügt über eine Lambda-DG-4-Lichtquelle sowie über eine x-, y- und Z-Achsen-Stage, die eine schnelle und präzise Bildaufnahme ermöglicht. In der Z-Achse sind alle Geräte integriert und werden über die Metamorph-Software gesteuert.Das Experiment wird bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 unter Verwendung eines Live-Cell-Kammer-Systems durchgeführt. Um Fokusveränderungen während der langen Aufnahmezeiten zu vermeiden, muss die Temperatur während des Experiments konstant bleiben. Nachdem Laser und Kamera synchronisiert wurden, muss eine geeignete Zelle für das Experiment ausgewählt werden.Eine gute Zelle sollte A einen klaren YFP MS two-Tag-Transkriptionsort über dem diffusen YFP MS two-Hintergrund aufweisen und B ausreichend freies YFP MS two-Protein in der Zelle enthalten, um sich vollständig nach der Photo-Bleiche erholen zu können. Als Nächstes geeignete Messbedingungen wählen. Das frat-Verfahren erfordert die Aufnahme vieler Bilder.Daher ist es wichtig, ein Gleichgewicht zwischen angemessenen Belichtungszeiten und der Verwendung möglichst geringer Lichtintensität zu finden. Um die Photobleiche zu minimieren, sollten Zellen im YFP-Kanal mit Belichtungszeiten von 150 Millisekunden pro Aufnahme abgebildet werden. Es werden sieben Z-Schnitte in Abständen von jeweils 350 Nanometern angefertigt.Die aktive Transkriptionsstelle wird mit dem 491 Nanometer Laser gebleicht. Nach dem Bleichen werden Bilder in einer Abfolge von drei Zeitfrequenzen aufgenommen: 15 Bilder alle drei Sekunden, 15 Bilder alle sechs Sekunden und 26 Bilder alle 30 Sekunden. Nachdem eine geeignete Zelle und geeignete Messbedingungen ausgewählt wurden, führen Sie das vollständige Experiment durch, jedoch ohne zu bleichen, um zu überprüfen, ob die Transkriptionsstelle funktionsfähig und im stationären Zustand stabil ist.Dies überprüft die Bildgebungsbedingungen, indem die gesamte durch die vollständige Bildserie verursachte Photobleiche gemessen wird. Führen Sie anschließend das FRAB-Experiment durch. Erstellen Sie zunächst sechs Präbleichbilder.Verwenden Sie dann den 491 Nanometer Laser, um das YFP MS2-Signal an der aktiven Transkriptionsstelle auszubleichen, und nehmen Sie nach dem Ausbleichen Bilder in einer Abfolge von drei Zeitfrequenzen auf: 15 Bilder alle drei Sekunden, 15 Bilder alle sechs Sekunden und 26 Bilder alle 30 Sekunden. Die 4D-FRAP-Daten werden mithilfe der kostenlosen Bildanalyse-Software Image analysiert.JZ-Stapel werden für jeden Zeitpunkt maximal projiziert, was einen 2D-Film über die Zeit ergibt. Zur weiteren Analyse wird die Transkriptionsstelle in jedem Einzelbild verfolgt und die mittlere Intensität gemessen. Mithilfe des Spot-Tracker-Tools werden die Daten in einer Excel-Tabelle gespeichert, um sie anschließend mit dem Time Series Analyzer-Plugin von ImageJ weiterzuverarbeiten. Messen Sie die mittleren Intensitäten in weiteren interessierenden Bereichen oder ROIs für jeden Zeitpunkt wie folgt: A) Messung des Hintergrunds aus einem ROI außerhalb der Zelle, B) Messung eines ROI im Nukleoplasma, der so weit wie möglich von der Bleichstelle entfernt liegt, und C) Messung der Transkriptionsstelle, nachdem die Intensität für die während der Aufnahme auftretende Photobleiche korrigiert wurde. Normalisieren Sie die Daten aus mindestens 10 Experimenten, um die kinetischen Parameter aus diesem Datensatz zu ermitteln.Das hier gezeigte einfachste beschriebene Modell, das für diese Art von Daten geeignet ist, stellt ein Schema dar, das die Eintritts- und Austrittskinetik von mit YFP MS markierten mRNA-Molekülen an der Transkriptionsstelle beschreibt. Dieses Modell umfasst die folgenden Gleichungen, die das Schema beschreiben. Mit Kenntnis der Modellparameter ist es möglich, die Elongationsrate anhand dieser Gleichung zu berechnen.Hier ist ein Beispiel einer Zelle dargestellt, in der eine aktive Transkriptionsstelle durch Photobleiche zerstört wurde und die Fluoreszenzwiederherstellung über die Zeit verfolgt wurde. Die Fluoreszenzintensität sowohl der gebleichten als auch der nicht gebleichten aktiven Transkriptionsstellen wurde gemessen. Dieses Diagramm zeigt die experimentellen Messungen an den CFP-ACT- und Gen-Transkriptionsstellen.Die Wiederherstellungskurven der beiden YFP MS-FP-Messungen sind in Blau dargestellt und zeigen die Messung des YFP MS-Signals an der Transkriptionsstelle. Im Verlauf der Zeit in einer nicht gebleichten Zelle desselben Experiments ergab sich ein konstantes Signal, angegeben durch die roten Punkte, was darauf hindeutet, dass dieses Gen derzeit in einem relativen stationären Zustand ist. Die Wiederherstellungskurve der YFP MS-FRAP-Messung wurde mithilfe von Berkeley Madonna analysiert, um diese angepasste Simulation zu generieren.Die berechneten Residuen der Anpassung werden unten dargestellt. Abschließend werden die Modellergebnisse in dieser Parametertabelle gezeigt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Transkription zu beantworten, beispielsweise welche Transkriptionsraten in vivo vorliegen und welche ko-transkriptionellen Prozesse die Kinetik beeinflussen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Transkriptionsprozess in Echtzeit verfolgen kann. Diese Technik kann erweitert werden, um die Kinetik anderer Transkriptionsfaktoren oder RNA-Verarbeitungsfaktoren an aktiv transkribierenden Genen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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