In-vitro-Phagozytose-Assay: Eine auf Live-Bildgebung basierende Methode zur Untersuchung der Echtzeit-Astrozyten-vermittelten Synaptosomen-Phagozytose

Synaptosomen sind isolierte neuronale Fraktionen, die reich an synaptischen Vesikeln sind. Diese Synaptosomen werden von Astrozyten - einer Population von Immunzellen im Gehirn - durch einen Prozess verschlungen, der als Phagozytose bekannt ist.

Um die Astrozyten-vermittelte Phagozytose in vitro zu untersuchen, beginnen Sie mit der Entnahme einer Kulturplatte, die eine Monoschicht von Astrozyten enthält. Geben Sie nun eine pH-Indikator-konjugierte Synaptosomensuspension in die Platte. Dieser Indikatorfarbstoff hat die Eigenschaft, ausschließlich bei einem niedrigen pH-Wert zu fluoreszieren. Inkubieren Sie die Platte für die gewünschte Dauer.

Während der Inkubation ermöglicht Phosphatidylserin oder PS, das auf der äußeren Membran des Synaptosoms vorhanden ist, dass es an die entsprechenden PS-Rezeptoren auf der Astrozytenmembran bindet. Dies erleichtert die Ansiedlung von Synaptosomen an der Basis. Aspirieren Sie das verbrauchte Medium zusammen mit ungebundenen Synaptosomen von der Platte.

Ergänzen Sie die Platte anschließend mit Phagozytose-fördernden Faktoren und inkubieren Sie. Anschließend wird die Platte mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet. Nach der Bindung an die Oberfläche verschlingen Astrozyten die Synaptosomen, wodurch sie in die Phagosomen gelangen. Sobald sie sich in den Phagosomen befinden, führt der niedrige pH-Wert dazu, dass die Indikatorfarbstoffmoleküle hell fluoreszieren.

Die Echtzeit-Bildgebung zeigt das Vorhandensein von hellen fluoreszierenden Flecken, die dem pH-Indikator entsprechen, konjugierte Synaptosomen, die von den Astrozyten verschlungen werden. Schließlich verschwinden diese Flecken, was auf einen erfolgreichen Abbau der Synaptosomen hinweist.

Für die Live-Bildgebung des Synaptosomen-Engulfments entfernen Sie zunächst den Überstand aus jeder Vertiefung einer konfluenten Astrozytenkultur und waschen die Zellen schnell dreimal mit 1 Milliliter DPBS pro Waschgang. Fügen Sie nach der letzten Wäsche 300 Mikroliter immungepaniertes Astrozyten-Basismedium und 5 Mikroliter der pH-Indikator-konjugierten Synaptosomen sowie alle zusätzlichen Faktoren hinzu, die die Phagozytose der Gliazellen modulieren können.

Lassen Sie die Synaptosomen sich am Boden der Vertiefungen absetzen und sich bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid an Phosphatidylserinrezeptoren auf den Astrozyten binden. Entsorgen Sie nach 40 Minuten die Überstände und waschen Sie die Vertiefungen schnell, aber vorsichtig dreimal mit 1 Milliliter DPBS pro Waschgang.

Nach dem letzten Waschen 500 Mikroliter frisches Medium, ergänzt mit den interessierenden Faktoren, in die entsprechenden Vertiefungen geben und die Platte in ein Live-Imaging-Instrument überführen. Wählen Sie die Bildgebungspositionen aus, passen Sie den Fokus, die Belichtungszeit, die Helligkeit und die LED-Leistung an und stellen Sie das Bildformat, das Zeitintervall und die Gesamtzahl der Zyklen für die Live-Bildgebung nach experimenteller Eignung ein. Beginnen Sie dann mit der Live-Bildgebung der Phagozytose-Experimente.

• Synaptosomes - Isolated neuronal fractions rich in synaptic vesicles.
• Astrocytes - A population of immune cells in the brain.
• Phagocytosis - The process by which astrocytes engulf synaptosomes.
• Phosphatidylserine (PS) - A component of the outer membrane of the synaptosome that allows binding to astrocyte receptors.
• pH-Indicator Conjugated Synaptosome - A synaptosome functionally paired with an indicator dye that fluoresces at low pH.

• Introduce Synaptosomes - Define and contextualize neuronal fractions vital for astrocyte communication (e.g., synaptic vesicles).
• Outline Phagocytosis - Summarize the principles of how astrocytes consume synaptosomes (e.g., in vitro phagocytosis).
• Explain Uptake Mechanisms - Briefly describe PS interaction and synaptosome incorporation.
• Connect to Experiment - Link the theoretical background to studying astrocyte-mediated phagocytosis in lab conditions.

• What is phagocytosis and how is it executed by astrocytes?
• How does phosphatidylserine facilitate astrocyte-synaptosome interaction?
• What can the disappearance of fluorescent spots indicate in the experiment?

• Describe Practical Applications - Using this knowledge for advancement in neurological studies (e.g., phagocytosis assay).
• Industry Impact - Potential benefits in healthcare and pharmaceutical sectors.
• Societal Importance - Broader benefits in understanding brain function and disease.
• Link to Scientific Advancements - Innovation tied to imaging techniques and phagocytosis assays.