Glykogenverzweigungsassay zur Messung des Grades der Glykogenverzweigung

Verzweigte Polysaccharide, wie z. B. Glykogen, umfassen Glukosereste, die linear über alpha-1,4-glykosidische Bindungen und in Verzweigungen über alpha-1,6-glykosidische Bindungen verknüpft sind.

Um den Grad der Verzweigung von Polysacchariden zu bestimmen, beginnen Sie mit einem wässrigen Farbreagenz, das Kaliumiodid, Jod und Calciumchlorid enthält. Unter wässrigen Bedingungen ergeben Kaliumiodid und Jod Iodidionen.

Mischen Sie das Reagenz in separaten Mikrozentrifugenröhrchen mit Polysacchariden bekannter Aststrukturen und einer Glykogenprobe mit einer nicht charakterisierten Struktur.

Polysaccharide nehmen über ihre alpha-1,4-glykosidischen Bindungen helikale Strukturen an. Die Iodid-Ionen binden an diesen helikalen Kern und bilden lineare Polyiodidketten. Dies führt zur Bildung von Ladungstransferkomplexen zwischen den Polysacchariden und den Polyiodidketten, was zu farbigen Polysaccharid-Iodid-Komplexen führt.

Unverzweigte Polysaccharide mit längeren Polyiodidketten entwickeln eine blaue Farbe, während verzweigte Polysaccharide mit kürzeren Polyiodidketten gelbliche bis orange-braune Komplexe entwickeln. Das Calciumchlorid im Reagenz intensiviert die komplexe Farbe.

Die Mischung in Einwegküvetten umfüllen. Messen Sie mit einem Spektralphotometer das Absorptionsspektrum von 330 bis 800 Nanometern.

Unverzweigte Komplexe mit blauer Farbe absorbieren Licht bei längeren Wellenlängen, was eine Rechtsverschiebung der Absorptionsmaxima zeigt. Im Gegensatz dazu absorbieren verzweigte Komplexe Licht bei kürzeren Wellenlängen, wobei die Linksverschiebung der Absorptionsmaxima auf eine höhere Verzweigung in der Struktur hinweist.

Die Absorptionsmaxima der uncharakterisierten Glykogenprobe bei etwa 450 Nanometern bestätigen ihre verzweigte Struktur.

Um die Glykogenverzweigung zu bestimmen, kombinieren Sie 650 Mikroliter Jod/Calciumchlorid-Farbreagenzstock mit 100 Mikrolitern Wasser in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen und mischen Sie die Lösung gründlich, bevor Sie sie in eine Einweg-Methacrylatküvette umfüllen. Platzieren Sie die Küvette in das Spektralphotometer, um einen Lauf im Wellenlängen-Scanmodus durchzuführen, um das Hintergrundspektrum von 330 bis 800 Nanometern zu erfassen.

Kombinieren Sie in einem separaten 1,5-Milliliter-Röhrchen 650 Mikroliter des Arbeitsjod/Calciumchlorid-Farbreagenzes mit 50 Mikrogramm des Austernglykogens und füllen Sie das endgültige Volumen auf 750 Mikroliter mit Wasser auf. Nachdem Sie die Mischung gründlich gemischt haben, geben Sie die Lösung in eine Einweg-Methacrylatküvette, um ein Absorptionsspektrum von 330 bis 800 Nanometern zu sammeln.

In ähnlicher Weise erhalten Sie ein Absorptionsspektrum mit 50 Mikrogramm Amylopektin und 30 Mikrogramm Amylose, wie zuvor beschrieben.

Um einen Hinweis auf die verzweigte Struktur einer nicht charakterisierten Glykogenprobe zu erhalten, kombinieren Sie 25 bis 50 Mikrogramm des Glykogens mit 650 Mikrolitern des Arbeitsjod/Calciumchlorid-Farbreagenzes und gehen Sie wie zuvor erläutert vor, um das Absorptionsspektrum zu erfassen.