5-Methylcytosin-Dot-Blot zur Bestimmung des Ausmaßes der DNA-Methylierung

Die DNA-Methylierung ist eine epigenetische Modifikation, bei der eine Methylgruppe an die Cytosinbase der DNA angehängt wird, um 5-Methylcytosin zu bilden. Diese Modifikation verändert die Genexpression.

Um die DNA-Methylierung mittels Dot-Blot zu quantifizieren, nehmen Sie genomische DNA-Proben, die von menschlichen Chondrozyten in verschiedenen Stadien der Dedifferenzierung stammen und unterschiedliche Konzentrationen von methyliertem Cytosin aufweisen.

Behandeln Sie die DNA-Proben mit Natriumhydroxid – einem starken Alkali – und erhitzen Sie sie. Diese Behandlung bricht die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden DNA-Strängen auf, was zu einer DNA-Denaturierung führt. Fügen Sie Ammoniumacetat hinzu, um das Alkali zu neutralisieren und einen übermäßigen DNA-Abbau zu verhindern.

Nehmen Sie eine Nylonmembran und punktulieren Sie denaturierte DNA-Proben in Form von Punkten. Die negativ geladene DNA bindet über elektrostatische Wechselwirkungen an die positiv geladene Nylonmembran, was dazu führt, dass sie auf dem festen Träger abgesetzt wird.

Behandeln Sie die gefleckte Membran mit einem Blockierungspuffer, um eine unspezifische Bindung zu verhindern. Als nächstes fügen Sie der Membran Anti-5-Methylcytosin-Antikörper hinzu und inkubieren. Diese Antikörper binden ausschließlich an das methylierte Cytosin auf der DNA.

Waschen Sie, um die ungebundenen Antikörper zu entfernen, und fügen Sie chemilumineszierende, enzymkonjugierte Sekundärantikörper hinzu, die spezifisch an die primären Antikörper binden.

Geben Sie ein chemilumineszierendes Substrat auf die Membran. Das Enzym auf dem Antikörper reagiert mit dem Substrat, um Chemilumineszenz zu erzeugen – was zu Punkten unterschiedlicher Intensität führt.

Bilden Sie die Membran ab und messen Sie die Intensität der Punkte, die dem Ausmaß der DNA-Methylierung in jeder Probe entspricht.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die isolierte DNA 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius in 0,1 molarem Natriumhydroxid denaturieren. Neutralisieren Sie die DNA mit 1 molaren Ammoniumacetat auf Eis und verdünnen Sie sie dann zweifach mit doppelt destilliertem Wasser.

Der kritischste Schritt beim Dot-Blot ist das Flecken der Proben auf der Membran, führen Sie dies langsam und vorsichtig durch. Versuchen Sie, jeden gefleckten Bereich auf einen Durchmesser von 3 bis 4 Millimetern zu minimieren.

Platzieren Sie mit einer Enghalspipettenspitze vorsichtig 2 Mikroliter der seriell verdünnten genomischen DNA auf einer positiv geladenen Nylonmembran in der Mitte des Gitters. Tupfen Sie die Membran bei 80 Grad Celsius 30 Minuten lang ab. Blockieren Sie anschließend die unspezifischen Antikörper-Bindungsstellen, indem Sie die Membran in einer 10 Zentimeter großen Petrischale 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln in 5 % BSA in TBST einweichen.

Waschen Sie die Membran nach 1 Stunde dreimal für jeweils 5 Minuten in TBST. Inkubieren Sie die Membran über Nacht mit einem monoklonalen Anti-5-Methylcytosin-Antikörper der Maus in TBST bei 4 Grad Celsius. Waschen Sie die Membran am nächsten Tag dreimal für jeweils 5 Minuten in TBST.

Dann inkubieren Sie mit einem Sekundärantikörper – Meerrettichperoxidase-konjugiertem Schaf-Anti-Maus-Immunglobulin G in TBST für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Membran wie zuvor in TBST gewaschen haben, fügen Sie der Membran das Enzymsubstrat hinzu und inkubieren Sie sie 5 bis 10 Minuten lang. Visualisieren Sie abschließend das Sekundärantikörpersignal mit einem Chemilumineszenz-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.