Magnetische Isolierung von Mikroglia aus dem Gehirn von Maus-Welpen

Mikroglia – die im Gehirn ansässigen Makrophagen – exprimieren CD11b, ein Integrin auf der Zelloberfläche.

Um Mikroglia aus dem Gehirn von Mäusewelpen zu isolieren, nehmen Sie Großhirnfragmente in Dissoziationsröhrchen, die Puffer mit Papain, einem proteolytischen Enzym, und Desoxyribonuklease enthalten.

Legen Sie die Röhrchen auf einen mechanischen Dissoziator. Während des Laufs bricht der Dissoziator das Gewebe mechanisch auf.

Papain verdaut die extrazelluläre Matrix des Gewebes und setzt Zellen, einschließlich Mikroglia, in Suspension frei. Desoxyribonuklease baut freie DNA in Suspension ab und verhindert so eine ineffiziente Zellisolierung.

Zentrifuge. Schließen Sie die mechanische Dissoziation durch Pipettieren ab. Übertragen Sie die Suspension durch ein Zellsieb, um Ablagerungen und Zellklumpen zu entfernen und eine homogene Einzelzellpopulation zu erhalten.

Inkubieren Sie mit superparamagnetischen Mikrokügelchen, die mit Anti-CD11b-Antikörpern funktionalisiert sind. Die Mikrokügelchen binden spezifisch an CD11b auf Zellen, einschließlich Mikroglia.

Nach der Inkubation, Zentrifuge. Entfernen Sie den Überstand mit den ungebundenen Kügelchen. Resuspendieren Sie die Zellen im Puffer. Laden Sie auf eine Säule, die auf einem Magnetabscheider platziert ist. Die Säule besteht aus einer Matrix mit ferromagnetischen Kügelchen.

Wenn sie auf den Separator gelegt werden, verstärken die Kugeln innerhalb der Säule das Magnetfeld und halten die an Mikroperlen gebundenen CD11b+-Zellen in der Säule, während andere Zellen hindurchfließen.

Nehmen Sie es aus dem Separator und verwenden Sie den Puffer, um die CD11b+-Zellen aus der Spalte zu eluieren. Zentrifugieren Sie die Suspension und resuspendieren Sie die CD11b+-Zellen in einem Mikroglia-Medium.

Die isolierten Zellen sind bereit für die weitere Analyse.

Bereiten Sie die Dissoziationsmischung gemäß dieser Tabelle vor. Übertragen Sie 12 Gehirnstücke in eine C-Sonde für ein Gesamtgewicht von 1,2 Gramm pro Dissoziationsröhrchen. Platzieren Sie dann C-Rohre auf dem Dissoziator mit Heizung. Starten Sie das optimierte NTDK-Programm im Dissoziator. 20 Sekunden lang zentrifugieren. Schließen Sie die mechanische Dissoziation durch dreimaliges Pipettieren ab.

Übertragen Sie die Zellen in vier 15-Milliliter-Röhrchen mit angebrachten Sieben. Spülen Sie die Siebe mit 10 Millilitern HBSS mit Calcium und Magnesium. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang und entfernen Sie den Überstand mit einer 10-Milliliter-Pipette. Fügen Sie vorsichtig 10 Milliliter HBSS mit Kalzium und Magnesium hinzu und resuspendieren Sie das Pellet. Auch hier zentrifugieren und den Überstand entfernen.

Resuspendieren Sie das Pellet mit 6 Millilitern Sortierpuffer. Wiederholen Sie die Zentrifugation und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie dann 200 Mikroliter CD11b-Mikrokügelchenlösung hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen 15 bis 20 Minuten lang bei 4 Grad Celsius. Nach der Inkubation resuspendieren Sie das Pellet mit 6 Millilitern Sortierpuffer. Wiederholen Sie die Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet mit 8 Millilitern Sortierpuffer

Befolgen Sie anschließend das POSSEL-Programm auf dem Trenner, um acht Spalten vorzubereiten. Führen Sie die Zellen durch die Säule, indem Sie jeweils 1 Milliliter Zellsuspension hinzufügen. Mit 1 Milliliter Sortierpuffer eluieren Sie CD11b-positive Zellen auf einer sterilen Elutionsplatte. Bündeln Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen.

Zentrifugieren Sie das Pellet und resuspendieren Sie es mit 10 Millilitern kaltem Mikroglia-Medium. Zählen Sie die CD11b-positiven Zellen. Resuspendieren Sie die Zellen in kaltem Mikroglia-Medium, um eine Endkonzentration von 650.000 bis 700.000 Zellen pro Milliliter zu erhalten.