Isolierung und Kultivierung von primären zerebellären Körnerneuronen der Maus

Nehmen Sie ein frisch geerntetes Mäusewelpengehirn.

Trennen Sie das Kleinhirn und entfernen Sie seine membranöse Schicht.

Entfernen Sie von der ventralen Seite aus das Netzwerk der Blutgefäße.

Hacken Sie das Kleinhirn in Fragmente und geben Sie sie in ein Röhrchen mit Puffer.

Zentrifugieren Sie und entsorgen Sie den Überstand, der Rückstände enthält.

Fügen Sie Trypsin, ein proteolytisches Enzym, hinzu, um die extrazelluläre Matrix des Gewebes zu verdauen und die Zellen zu lockern.

Fügen Sie einen Puffer hinzu, der Trypsin-Inhibitor und DNase enthält.

Der Inhibitor stoppt die Trypsin-Aktivität, während DNase jegliche kontaminierende DNA abbaut.

Dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch, um eine Zellsuspension zu bilden, einschließlich Kleinhirn-Körnerneuronen und nicht-neuronaler oder glialer Zellen.

Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Röhrchen.

Puffer hinzufügen. Zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in Medien und plattieren Sie sie auf Kulturplatten, die mit Poly-D-Lysin beschichtet sind.

Die Zellen heften sich an die beschichteten Oberflächen.

Fügen Sie einen Antimetaboliten hinzu, um proliferierende Gliazellen zu eliminieren und eine Reinkultur von Kleinhirn-Körnerneuronen zu erzeugen.

Um das Kleinhirn zu isolieren, legen Sie das Gehirn in die mit Magnesiumsulfat versetzte Sezierlösung und halten Sie die Lösung und das Gehirn auf Eis.

Unter einem Präpariermikroskop werden die Hirnhäute mit einer feinen Pinzette entfernt. Präparieren Sie dann das Kleinhirn aus dem Gehirn in einer mit Magnesiumsulfat angereicherten Dissektionslösung. Dies hilft beim Ablösen der verbleibenden Hirnhäute und ermöglicht es einem, zwischen den Schichten zu gehen, um die Kleinhirnfalten zu reinigen.

Das Vorhandensein von Hirnhäuten in neuronalen Kulturen führt zu ungesunden Zellen und schließlich zum Zelltod. Daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Hirnhäute vollständig entfernt werden, bevor mit der Kultur fortgefahren wird.

Drehen Sie danach das Kleinhirn auf seine ventrale Seite und sorgen Sie für die Entfernung des Plexus choroideus. Als nächstes geben Sie das Kleinhirn in eine 35-Millimeter-Schale, die 1 Milliliter mit Magnesiumsulfat angereicherte Dissektionslösung enthält. Hacken Sie das Gewebe in kleine Stücke und geben Sie es in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 30 Millilitern Magnesiumsulfat-gepufferter Dissektionslösung.

In diesem Schritt zentrifugieren Sie das 50-Milliliter-Röhrchen mit dem gehackten Hirngewebe fünf Minuten lang bei 644 mal g und 4 Grad Celsius. Entfernen Sie danach den Überstand und fügen Sie 10 Milliliter Trypsin-Dissektionslösung hinzu. Schütteln Sie dann den Tisch 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit hoher Geschwindigkeit.

Geben Sie 10 Milliliter Trypsin-Inhibitor-Lösung-I in das Röhrchen und wiegen Sie zwei Minuten lang vorsichtig. Anschließend zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 644 mal g und 4 Grad Celsius. Entfernen Sie nach fünf Minuten den Überstand und fügen Sie 2 Milliliter Trypsin-Inhibitor-Lösung-II hinzu, bevor Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen.

Zerreiben Sie dann das Gewebe in der 15-Milliliter-Tube, bis die Lösung trüb wird. Lassen Sie es fünf Minuten ruhen. Entfernen Sie dann den klaren Überstand und geben Sie ihn in ein neues Röhrchen mit 1 Milliliter Calciumchlorid-supplementierter Dissektionslösung.

Geben Sie weitere 2 Milliliter Trypsin-Inhibitor-Lösung-II auf den Boden des Röhrchens, das das Pellet enthält. Zerreiben Sie es erneut und lassen Sie es fünf Minuten ruhen. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie ihn in das Röhrchen, das den Überstand aus dem vorherigen Schritt enthält. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der größte Teil des Gewebes mechanisch dissoziiert ist.

Für jeden Milliliter Überstand werden 0,3 Milliliter mit Calciumchlorid ergänzte Dissektionslösung zur Überstandssammlung hinzugefügt. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens und zentrifugieren Sie dann fünf Minuten lang bei 644 mal g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie anschließend den Überstand. Geben Sie 10 Milliliter Frischmedium zum Pellet und mischen Sie.

Zählen Sie dann die lebenden Zellen und verdünnen Sie sie auf eine Konzentration von 1,5 x 10⁶ Zellen pro Milliliter. Plattieren Sie die Zellen auf den zuvor vorbereiteten Poly-D-Lysin-Platten. Bei Vier-Well-Platten werden 0,5 Milliliter der Probe gegeben, was 7,5 x 10⁵ Zellen pro Well ergibt. Bei 35-Millimeter-Schalen werden 4 Milliliter der Probe auf eine Platte gesetzt, so dass 6 x 10⁶ Zellen pro Platte vorhanden sind. Für Deckgläser eine Platte von 0,5 ml mit 7,5 x 10⁵ Zellen pro Vertiefung auffüllen.

Fügen Sie nach 24 Stunden AraC auf zwei Platten hinzu, um die Kontamination der Gliazellen zu reduzieren. Wenn die Zellen sieben bis acht Tage lang aufbewahrt werden sollen, wiederholen Sie diese Behandlung an Tag 3 und halten Sie die Kulturen in einem 5%igen CO₂ -Inkubator bei 37 Grad Celsius.