siRNA-vermitteltes Gen-Silencing in neuralen Stammzellen

Nehmen wir die kleine interferierende RNA oder siRNA, eine Art von RNA, die am Gen-Silencing beteiligt ist.

Fügen Sie kugelförmige Lipidvesikel hinzu, die Liposomen genannt werden.

Das Liposom kapselt die siRNA ein und schützt sie so vor dem Abbau.

Geben Sie siRNA-Liposomen-Komplexe in eine Kulturvertiefung, die neurale Stammzellen enthält. Bewahren Sie einen Brunnen als Kontrolle auf und inkubieren Sie.

Das Liposom verschmilzt mit der Zellmembran und setzt die siRNA frei.

Die siRNA bindet an den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC), bei dem ein Strang entfernt wird.

Der verbleibende Strang zielt auf die mRNA ab, die für die Zelldifferenzierung verantwortlich ist, was zu deren Abbau führt.

Geben Sie ein geeignetes Differenzierungsmedium in die Vertiefungen.

In der Kontrollvertiefung fördern die Wachstumsfaktoren und andere Nährstoffe im Medium die Differenzierung von neuralen Stammzellen zu Osteoblasten.

Mit geeigneten Färbetechniken werden Osteoblasten-spezifische Marker auf den Zellen angefärbt und der Zellkern mit einem blauen Fluoreszenzfarbstoff angefärbt.

Das Fehlen von Osteoblasten-spezifischen Markern in den genstummgeschalteten Zellen deutet auf ihre Unfähigkeit zur Differenzierung hin.

Um einen siRNA-Knockdown in O9-1 durchzuführen, gewinnen die Zellen die Zellen zurück und säen sie aus. Verdünnen Sie die Liposomen in einem geeigneten Volumen serumfreier Medien. Verdünnen Sie dann die siRNA in serumfreien Medien gemäß dem Textprotokoll. Fügen Sie danach die verdünnte siRNA gemäß den Anweisungen des Herstellers zu den verdünnten Liposomen hinzu. Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Als nächstes fügen Sie den Zellen ein entsprechendes Volumen des siRNA-Lipid-Komplexes hinzu. Inkubieren Sie die Zellen dann 24 Stunden lang in einem Standard-Zellkultur-Inkubator. O9-1-Zellen können sich unter spezifischen Differenzierungskulturbedingungen in verschiedene Zelltypen differenzieren. Um O9-1-Zellen in Osteoblasten zu differenzieren, werden osteogene Differenzierungsmedien gemäß dem Textprotokoll hergestellt. Schließlich wird der Osteoblastenmarker Osteocalcin in differenzierten Osteoblasten durch Immunfärbung nachgewiesen.