Kultivierung und Erhaltung dopaminerger Neuronen aus embryonalem Hirngewebe der Maus
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 4:22 Min. • July 8th, 2025
Behandeln Sie das embryonale Mittelhirngewebe, das reich an sich entwickelnden dopaminergen Neuronen ist, mit einer Trypsin-EDTA-Lösung, um sie von der Gewebematrix zu lösen.
Fügen Sie ein Deaktivierungsmedium hinzu, um die Enzymaktivität zu hemmen, und waschen Sie es dann, um verbleibende Enzyme zu entfernen.
Pipettieren Sie das Gewebe wiederholt. Die embryonalen Neuronen besitzen weniger Projektionen, wodurch der Stress während dieser Störung reduziert und eine einzellige Suspension erzeugt wird.
Zentrifugieren und entfernen Sie den Überstand, dann resuspendieren Sie die Neuronen in einem vollständigen Medium. Übertragen Sie diese Neuronen zur Zellanheftung auf ein polymerbeschichtetes Deckglas.
Legen Sie das Deckglas in eine Multi-Well-Platte mit einem vollständigen Medium, das Nährstoffe und Wachstumsfaktoren enthält, die für das Neuronenwachstum unerlässlich sind.
Die Antibiotika im Medium verhindern das Bakterienwachstum und unterstützen so die Lebensfähigkeit der Neuronen.
Wenn Neuronen wachsen und reifen, entwickeln sie zelluläre Fortsätze wie Axone und Dendriten und bilden synaptische Verbindungen.
Entfernen Sie in regelmäßigen Abständen die Hälfte der verwendeten Medien, um giftige Nebenprodukte zu beseitigen.
Fügen Sie ein frisches Medium für die langfristige Erhaltung der dopaminergen Neuronen hinzu.
Entfernen Sie das HBSS unter einer Haube aus der Sammlung des ventralen Mittelhirns. Fügen Sie dann einen Milliliter warme 0,05% Trypsin-EDTA hinzu, genug Lösung für 12 Gewebestücke. Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 Grad Celsius für 5 bis 10 Minuten. Ersetzen Sie unter der Haube das Trypsin-EDTA durch 1 Milliliter Deaktivierungsmedium.
Schwenken Sie die Mischung vorsichtig und entfernen Sie dann das Deaktivierungsmedium, aber lassen Sie genügend Medium zurück, damit dissoziierte Zellen nicht verworfen werden. Waschen Sie anschließend das Gewebe zweimal mit vollständigem Medium, ohne die Zellen zu verlieren. Fügen Sie nun 1 Milliliter des vollständigen Mediums hinzu. Dann zerreiben Sie das Gewebe mit der feuerpolierten Pipette, ohne Blasen zu bilden, bis eine einzellige Suspension erhalten wird. Etwa 8 bis 10 Durchgänge sollten ausreichen.
Nach der Verreibung zentrifugieren Sie die Zellen von 400 g für 5 Minuten. Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in 1 Milliliter vollständigem Medium. Pipettieren Sie die Zellen bis zu 4 Mal, um eine Suspension zu erhalten. Beginnen Sie mit dem Zählen und Beurteilen der Gesundheit der Zellen in der Suspension unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses mit einem Hämozytometer.
Stellen Sie nun die Zellsuspension auf 1.500 Zellen pro Mikroliter ein. Übertragen Sie dann die sterilisierten Kappen der Mikrozentrifugenröhrchen in 100-Millimeter-Schalen. Legen Sie die vorbereiteten Deckgläser mit einer Pinzette auf die Kappen. Waschen Sie die Deckgläser nicht und versuchen Sie, sie nicht austrocknen zu lassen. Laden Sie 100 Mikroliter Suspension auf jedes Deckglas.
Diese etwas ungewöhnliche Methode bietet eine Kulturfähigkeit von 90 % und ist ein entscheidender Schritt zum Erfolg. Schließen Sie dann die Petrischale und stellen Sie sie für eine Stunde in den Inkubator. Nach der Inkubation werden die Deckgläser mit dem Medium vorsichtig auf 24-Well-Platten übertragen, die jeweils 400 Mikroliter des auf 37 Grad Celsius erwärmten Mediums enthalten. Inkubieren Sie die Zellen dann über Nacht.
Die ersten Stunden sind für das Überleben der Zellen am kritischsten. Geben Sie innerhalb von 24 Stunden vorsichtig einen halben Milliliter des vollständigen Mediums in jede Vertiefung. Wechseln Sie alle 2 Wochen die Hälfte des Mediums. Wenn die Kultur gelb wird, kann die halbmediale Änderung früher durchgeführt werden, aber die Änderung sollte immer noch selten erfolgen. Dopaminerge Neuronen überleben unter diesen Bedingungen mehr als 6 Wochen.
Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Isolierung dopaminerger Neuronen aus embryonalem Mittelhirngewebe beschrieben. Die Methode betont die Bedeutung der Aufrechterhaltung der Zellviabilität und Förderung des neuronalen Wachstums durch sorgfältige Handhabung und Mediumpflege.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Dopaminerge Neuronen sind für verschiedene neurologische Funktionen von entscheidender Bedeutung.
- Isolationsmethoden sind unerlässlich, um das Verhalten und die Eigenschaften von Neuronen zu untersuchen.
- Die Aufrechterhaltung der Zellviabilität ist entscheidend für eine erfolgreiche neuronale Kultur.
- Embryonales Mittelhirngewebe ist reich an sich entwickelnden dopaminergen Neuronen.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Isolierung dopaminerger Neuronen bereitzustellen.
- Die hohe Vitalität und das Wachstum kultivierter Neuronen sicherzustellen.
- Die weitere Erforschung der Funktionen dopaminerger Neuronen zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Behandlung von embryonalem Mittelhirngewebe mit Trypsin-EDTA zur Zellablösung.
- Verwendung eines Desaktivierungsmediums zur Hemmung der Enzymaktivität.
- Waschen und erneutes Suspenderen der Neuronen in komplettem Medium.
- Sorgfältige Mediumwechsel zur Aufrechterhaltung optimaler Wachstumsbedingungen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erzeugung einer Einzelzell-Suspension aus Mittelhirngewebe.
- Hohe Kulturviabilität durch sorgfältige Handhabung erreicht.
- Neuronen bildeten zelluläre Fortsätze aus und gingen synaptische Verbindungen ein.
- Langzeit-Erhaltung dopaminerger Neuronen nachgewiesen.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode eignet sich zur Isolierung und Kultivierung dopaminerger Neuronen.
- Ein sachgemäßer Umgang mit dem Kulturmedium ist entscheidend für die Gesundheit der Neuronen.
- Dieses Protokoll kann dazu beitragen, die Forschung zu den Funktionen dopaminerger Neuronen voranzutreiben.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die etablierte Kultur zuverlässiger dopaminergener Neuronen ermöglicht die mechanistische Risikominderung bei der Zielvalidierung für die Parkinson-Krankheit und die Entwicklung von Assays. Diese Methode unterstützt die phänotypische Bildschirmanalyse, indem sie ein krankheitsrelevantes System bereitstellt, um die Wirkung von Substanzen auf das neuronale Überleben und die Funktion zu bewerten. Die Möglichkeiten zur Langzeitkultivierung fördern die Entwicklung präklinischer Modelle und translationsmedizinischer Biomarker-Studien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Überlebenswegen dopaminerger Neuronen und die Analyse der Zielstrukturen in einem physiologisch relevanten Kontext.
- Operationaler Wert: Bietet ein standardisiertes System zur Beurteilung der Zielmodulation und funktioneller Messgrößen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die biologische Risikominderung vor Beginn der Lead-Identifizierung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare Ergebnisse wie Neuritauswuchs und synaptische Bildung zur Standardisierung von Assays.
- Operativer Wert: Ermöglicht reproduzierbares Beimpfen und Mediummanagement für die Kompatibilität mit Hochdurchsatz-Screenings.
- Skalierbarkeit: Unterstützt Mehrfach-Well-Plattenformate für Dosis-Wirkungs- und Zeitverlaufsuntersuchungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Bietet ein primäres Neuronensystem zur Modellierung von Mechanismen des dopaminergen Zelluntergangs.
- Translationale Kontinuität: Verbindet entdeckte Befunde mit der präklinischen Validierung durch konsistente neuronale Phänotypen.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch basierend auf neuroprotektiven oder toxikologischen Profilen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode ermöglicht im frühen Entdeckungsstadium die Zielvalidierung, schreitet voran zur Screening-Phase zur Identifizierung von Leitverbindungen und unterstützt die präklinische Evaluierung durch langzeitstabile neuronale Kulturen.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung dopaminerger Signalwege und die Zielstrukturklärung in embryonalen Mittelhirn-neuronalen Zellen.
- Screening: Bereitstellung von versuchsreifen Kulturen mit definierten Vitalitätsschwellenwerten und reproduzierbaren Ansiedlungsdichten.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Messungen zellulärer Fortsätze, synaptischer Marker und Vitalitätsassays für die Bedingungsvergleiche.
- Translationale Forschung: Erhält krankheitsrelevante neuronale Phänotypen über sechs Wochen hinweg, um die präklinische Kontinuität sicherzustellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine skalierbare Plattform für neuronale Kulturen, die in mehreren Entdeckungskampagnen eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vertrauen in die Zielvalidierung durch physiologisch relevante neuronale Modelle.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Reproduzierbarkeit durch standardisierte Protokolle für die Dissoziation, das Ausplattieren und den Mediumwechsel.
- Strategischer Wert: Verringert die Ausscheidung in späteren Stadien, indem die Vorhersagegenauigkeit bei der neuropharmakologischen Bildschirmung verbessert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf Überlebensdaten dopaminerger Neuronen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Dissektion primärer neuronaler Gewebe und sterilen Zellkultivierungstechniken.
- Hängt vom Zugang zu Trypsin-EDTA, Inaktivierungsmedium, polymerbeschichteten Oberflächen und CO2-Inkubatoren ab.
- Setzt standardisierte Schulung für konsistente Trituration und Zellzählverfahren voraus.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Übertragung auf dopaminerge Neuronen, die aus humanen iPSCs abgeleitet sind.
- Ist durch die begrenzte Lebensdauer primärer Kulturen eingeschränkt und erfordert zeitlich festgelegte experimentelle Endpunkte.
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Zuletzt aktualisiert: 22 August 2026