Kultivierung und Erhaltung dopaminerger Neuronen aus embryonalem Hirngewebe der Maus

Behandeln Sie das embryonale Mittelhirngewebe, das reich an sich entwickelnden dopaminergen Neuronen ist, mit einer Trypsin-EDTA-Lösung, um sie von der Gewebematrix zu lösen.

Fügen Sie ein Deaktivierungsmedium hinzu, um die Enzymaktivität zu hemmen, und waschen Sie es dann, um verbleibende Enzyme zu entfernen.

Pipettieren Sie das Gewebe wiederholt. Die embryonalen Neuronen besitzen weniger Projektionen, wodurch der Stress während dieser Störung reduziert und eine einzellige Suspension erzeugt wird.

Zentrifugieren und entfernen Sie den Überstand, dann resuspendieren Sie die Neuronen in einem vollständigen Medium. Übertragen Sie diese Neuronen zur Zellanheftung auf ein polymerbeschichtetes Deckglas.

Legen Sie das Deckglas in eine Multi-Well-Platte mit einem vollständigen Medium, das Nährstoffe und Wachstumsfaktoren enthält, die für das Neuronenwachstum unerlässlich sind.

Die Antibiotika im Medium verhindern das Bakterienwachstum und unterstützen so die Lebensfähigkeit der Neuronen.

Wenn Neuronen wachsen und reifen, entwickeln sie zelluläre Fortsätze wie Axone und Dendriten und bilden synaptische Verbindungen.

Entfernen Sie in regelmäßigen Abständen die Hälfte der verwendeten Medien, um giftige Nebenprodukte zu beseitigen.

Fügen Sie ein frisches Medium für die langfristige Erhaltung der dopaminergen Neuronen hinzu.

Entfernen Sie das HBSS unter einer Haube aus der Sammlung des ventralen Mittelhirns. Fügen Sie dann einen Milliliter warme 0,05% Trypsin-EDTA hinzu, genug Lösung für 12 Gewebestücke. Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 Grad Celsius für 5 bis 10 Minuten. Ersetzen Sie unter der Haube das Trypsin-EDTA durch 1 Milliliter Deaktivierungsmedium.

Schwenken Sie die Mischung vorsichtig und entfernen Sie dann das Deaktivierungsmedium, aber lassen Sie genügend Medium zurück, damit dissoziierte Zellen nicht verworfen werden. Waschen Sie anschließend das Gewebe zweimal mit vollständigem Medium, ohne die Zellen zu verlieren. Fügen Sie nun 1 Milliliter des vollständigen Mediums hinzu. Dann zerreiben Sie das Gewebe mit der feuerpolierten Pipette, ohne Blasen zu bilden, bis eine einzellige Suspension erhalten wird. Etwa 8 bis 10 Durchgänge sollten ausreichen.

Nach der Verreibung zentrifugieren Sie die Zellen von 400 g für 5 Minuten. Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in 1 Milliliter vollständigem Medium. Pipettieren Sie die Zellen bis zu 4 Mal, um eine Suspension zu erhalten. Beginnen Sie mit dem Zählen und Beurteilen der Gesundheit der Zellen in der Suspension unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses mit einem Hämozytometer.

Stellen Sie nun die Zellsuspension auf 1.500 Zellen pro Mikroliter ein. Übertragen Sie dann die sterilisierten Kappen der Mikrozentrifugenröhrchen in 100-Millimeter-Schalen. Legen Sie die vorbereiteten Deckgläser mit einer Pinzette auf die Kappen. Waschen Sie die Deckgläser nicht und versuchen Sie, sie nicht austrocknen zu lassen. Laden Sie 100 Mikroliter Suspension auf jedes Deckglas.

Diese etwas ungewöhnliche Methode bietet eine Kulturfähigkeit von 90 % und ist ein entscheidender Schritt zum Erfolg. Schließen Sie dann die Petrischale und stellen Sie sie für eine Stunde in den Inkubator. Nach der Inkubation werden die Deckgläser mit dem Medium vorsichtig auf 24-Well-Platten übertragen, die jeweils 400 Mikroliter des auf 37 Grad Celsius erwärmten Mediums enthalten. Inkubieren Sie die Zellen dann über Nacht.

Die ersten Stunden sind für das Überleben der Zellen am kritischsten. Geben Sie innerhalb von 24 Stunden vorsichtig einen halben Milliliter des vollständigen Mediums in jede Vertiefung. Wechseln Sie alle 2 Wochen die Hälfte des Mediums. Wenn die Kultur gelb wird, kann die halbmediale Änderung früher durchgeführt werden, aber die Änderung sollte immer noch selten erfolgen. Dopaminerge Neuronen überleben unter diesen Bedingungen mehr als 6 Wochen.