Generierung von Explantat und dissoziierter Zellkultur aus dem Spinalganglion

Beginnen Sie mit dem Spinalganglion oder DRG-Gewebe in einem serumfreien Medium. Das DRG-Gewebe enthält sensorische Neuronen und Satelliten-Gliazellen, die in die extrazelluläre Matrix, die EZM, eingebettet sind.

Säen Sie sie auf eine Kulturschale, die mit einer gallertartigen Proteinmischung beschichtet ist, um die Gewebehaftung zu verbessern.

Im Laufe der Zeit setzen Gliazellen neurotrophe Wachstumsfaktoren frei, die neuronale Erweiterungen ermöglichen und eine DRG-Explantatkultur etablieren.

Um eine dissoziierte Zellkultur zu entwickeln, nehmen Sie diese DRG-Explantate in einem Röhrchen ein. Behandeln Sie sie mit Kollagenase, um die EZM abzubauen, und dann mit Trypsin, das die Zellverbindungen stört und Neuronen und Gliazellen freisetzt.

Fügen Sie ein mit Serum angereichertes Medium hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen.

Pipettieren Sie den Inhalt wiederholt, um eine einzellige Suspension zu erhalten, und filtern Sie sie, um Schmutz zu entfernen.

Diese Zellsuspension zentrifugieren und den enzymhaltigen Überstand entfernen.

Resuspendieren Sie die Zellen in einem neurobasalen Medium und übertragen Sie sie auf eine mit Laminin beschichtete Platte.

Die Satelliten-Gliazellen und sensorischen Neuronen haften an der Laminin-beschichteten Platte, wodurch eine dissoziierte Zellkultur entsteht.

Übertragen Sie jedes DRG in eine trockene Petrischale aus Glas. Unter einem Operationsmikroskop überschüssige Fasern und Bindegewebe, die noch am DRG haften, mit einer Klinge reinigen und abschneiden. Der DRG ist leicht als wulstige, transparente Struktur entlang des weißen Spinalnervs zu erkennen, und Blutgefäße sind oft um den DRG herum zu finden.

Danach wird das gereinigte Material in eine neue Petrischale mit eiskaltem, serumfreiem Medium gegeben. Verdünnen Sie die gallertartige Proteinmischung in eiskalten, serumfreien Medien im Verhältnis 1:1. Dann plättieren Sie das DRG ex vivo in die 12-Well-Platten, die mit 10 oder 20 Mikrolitern gallertartiger Proteinmischung vorbeschichtet sind, und halten Sie sie 30 bis 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie nun vorsichtig 1,5 bis 2 Milliliter serumfreies Medium in das Kultursystem, um das gesamte Explantat abzudecken und die Explantate unter Kultivierungsbedingungen zu halten. Wechseln Sie das DRG-Wachstumsmedium alle 72 Stunden. und die DRG so lange wachsen lassen, wie es nötig ist.

Dies ist ein kritischer Schritt, da DRG mit der gallertartigen Proteinmischung an der Glasplatte verankert wird. Daher sind die Polymerisationszeit und die Pipettierfähigkeiten entscheidend, um ein Floaten zu vermeiden.

Bei diesem Verfahren wird das gesamte gesammelte DRG in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen mit F12-Medien gegeben, das Kollagenase IV enthält, und 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Tauschen Sie danach das frische Medium mit Kollagenase IV aus und inkubieren Sie die Probe weitere 45 Minuten lang. Behandeln Sie dann die Explantate 30 Minuten lang mit 2 Millilitern F12-Medien mit 0,025 % Trypsin bei 37 Grad Celsius.

Unmittelbar nach der Kollagenase-IV-Behandlung inkubieren Sie sie 15 Minuten lang mit 2 Millilitern F12-Medien, die fötales Rinderserum bei 37 Grad Celsius enthalten. Waschen Sie anschließend die Explantate dreimal mit 2 Millilitern F12-Medien und dissoziieren Sie sie mechanisch mit einer Glaspipette, bis das Medium trüb wird.

Filtrieren Sie anschließend die dissoziierte Zellkultur durch einen 0,22-Mikrometer-Filter, um Verunreinigungen und überschüssiges Bindegewebe zu entfernen. Zentrifugieren Sie dann das gefilterte Zelllysat zwei Minuten lang. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern neurobasalem Medium. Platzieren Sie die dissoziierten Zellen auf lamininbeschichteten Deckobjekten mit einer bevorzugten Zelldichte.