Untersuchung der Wirkung von Pestiziden auf Neuronen von Caenorhabditis elegans

Beginnen Sie mit einer Agarplatte, die transgene Caenorhabditis elegans enthält, die grün fluoreszierende Proteine oder GFPs in ihren Neuronen exprimieren.

Gib steriles Wasser auf die Platte, schwenke es, um die Würmer anzuheben, und gib sie in ein Röhrchen.

Lassen Sie die Würmer sich absetzen, entfernen Sie dann das überschüssige Wasser und resuspendieren Sie sie.

Die resuspendierten Würmer werden auf eine mit Pestiziden beschichtete Platte und eine Kontrollplatte ohne Pestizide umgefüllt und inkubiert.

Aufgrund ihrer Wirkung schädigt das Pestizid spezifisch bestimmte Neuronen und verursacht eine neuronale Schwellung, wodurch die GFP-Expression verringert wird.

Übertragen Sie die Würmer auf ein Agarose-Pad, das ein Anästhetikum enthält, und legen Sie dann ein Deckglas auf.

Montieren Sie den Objektträger auf ein Fluoreszenzmikroskop. Visualisieren Sie zuerst die Würmer im Phasenkontrastmodus und wechseln Sie dann in den Fluoreszenzmodus.

Bei mit Pestiziden behandelten Würmern weisen Neuronen eine verminderte Fluoreszenz, geschwollene Soma und Lücken in den neuronalen Prozessen auf, was auf neurodegenerative Effekte hinweist.

Während sie unter Kontrolle sind, zeigen gesunde Neuronen ein intaktes Soma mit heller Fluoreszenz.

Mit einer Mikropipette 1 Milliliter steriles Wasser auf die Nematodenplatte geben. Schwenken Sie dann das Wasser herum, um die Nematoden anzuheben. Entfernen Sie dann die Flüssigkeit mit den Nematoden in ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen. Nach 10 Minuten, wenn sich die Nematoden durch die Schwerkraft ansiedeln, entfernen Sie vorsichtig mindestens 500 Mikroliter des Wassers und entsorgen Sie es.

Suspendieren Sie dann die Nematoden erneut und entfernen Sie mit einer abgeschnittenen gelben Pipettenspitze 50 bis 100 Mikroliter suspendierte Würmer auf jede Behandlungsplatte, wobei Sie sicherstellen, dass jede Platte mindestens 10 erwachsene Würmer enthält. Bereiten Sie zwei Objektträger vor, indem Sie ein Stück Etikettenband nur auf einer Seite der Objektträger platzieren, um ein Pad mit gleichmäßiger Dicke zu bilden.

Positionieren Sie dann eine saubere, unbenutzte Folie dazwischen auf der Arbeitsplatte. Geben Sie einen 10-Mikroliter-Tropfen geschmolzene Agarose mit einer Mikropipette auf die Mitte des Objektträgers. Glätten Sie dann den Tropfen, indem Sie einen weiteren sauberen Objektträger senkrecht zum Objektträger mit dem Tropfen darauf legen und Druck ausüben, sodass der Agarosetropfen die Dicke des Beschriftungsbandes bildet.

Üben Sie anschließend gleichmäßigen Druck aus, um die beiden Folien zu trennen. Legen Sie dann den Objektträger mit der Agar-Seite nach oben auf die Tischplatte und lassen Sie ihn ein bis zwei Minuten trocknen, bevor Sie ihn verwenden. Um dem vorbereiteten Objektträger mit dem Agarose-Pad Nematoden hinzuzufügen, geben Sie einen 5-Mikroliter-Tropfen Wasser mit 1 molar Natriumazid in das Agar-Pad, das die Würmer betäubt und mobilisiert.

Übertragen Sie dann mindestens 10 Nematoden pro Behandlungsobjektträger mit einem Wurmpickel auf das Tröpfchen, das vor und nach dem Transfer der Nematoden sterilisiert werden sollte. Fügen Sie anschließend mit einer Pinzette ein Deckglas hinzu, indem Sie es schräg platzieren und langsam absenken.

Anschließend setzen Sie die vorbereitete Nassmontierung auf ein Fluoreszenzmikroskop, um die Würmer zu beobachten, zuerst unter 10-facher Vergrößerung und Phasenkontrast, dann unter 40-facher Vergrößerung mit Phasenkontrast und fluoreszierender Beleuchtung.

Platzieren Sie jeweils eine vorbereitete Nasshalterung auf dem Mikroskoptisch und befestigen Sie sie mit den Clips des Mikroskoptisches. Beginnen Sie dann mit der Betrachtung der nassen Montierungen mit dem Objektiv mit der niedrigsten Vergrößerung, das normalerweise 10x beträgt, und verwenden Sie ein Hellfeld oder einen Phasenkontrast, um die Nematoden zu visualisieren und zu fokussieren.

Sobald sich ein Fadenwurm im Sichtfeld befindet, fokussieren Sie ihn mit dem Feinfokusknopf am Mikroskop. Schalten Sie dann die Beleuchtung auf Fluoreszenz um, indem Sie den Drehknopf drehen und das Licht auf die Kamera richten, um die digitalen Bilder aufzunehmen.

Passen Sie anschließend die Beleuchtung mit der Bildgebungssoftware so an, dass die Neuronen hell, aber nicht übersättigt sind. Zu einem bestimmten Zeitpunkt erhalten Sie ein separates Bild eines Lineals mit der gleichen Vergrößerung wie die Zellenbilder, um eine Vergrößerungsskala für ihre Figur bereitzustellen.