Stimulation von sensorischen Neuronen des Spinalganglion mit Hilfe eines Neuropeptidrezeptor-Agonisten

Nehmen Sie eine Multiwell-Platte mit transfizierten sensorischen Neuronen des Spinsalganglion der Ratte.

Die Neuronen der Testwelle weisen eine reduzierte Neuropeptidrezeptorexpression auf, während die Neuronen der Kontrollwelle physiologische Niveaus der Neuropeptidrezeptorexpression aufweisen.

Ersetzen Sie das Medium durch serumfreie Medien, um eine kontrollierte Umgebung für eine präzise Stimulationsreaktion zu schaffen.

Geben Sie einen Neuropeptidrezeptoragonisten in die Vertiefungen und mischen Sie. Inkubieren Sie die Platte.

In der Kontrollvertiefung bindet der Neuropeptid-Rezeptor-Agonist an die Zielrezeptoren und löst eine intrazelluläre Signalkaskade aus, die Neurotransmitter freisetzt.

In den Testvertiefungen begrenzt jedoch eine verringerte Neuropeptidrezeptorexpression die Agonistenbindung, was zu einer verminderten Neurotransmitterfreisetzung im Vergleich zur Kontrolle führt.

Sammeln Sie nach der Inkubation das Medium aus den Vertiefungen und zentrifugieren.

Übertragen Sie den Überstand in Röhrchen und verwenden Sie einen geeigneten Immunoassay, um den Neurotransmitterspiegel zu messen. Die Kontrollprobe zeigte eine höhere Neurotransmitterfreisetzung als die Testprobe nach Stimulation mit Neurorezeptor-Agonisten.

Am Tag 6, nach der Plattierung und 72 Stunden nach der siRNA-Transfektion, wechseln Sie das Nährmedium auf 200 Mikroliter serumfreies Medium. Nach einer 30-minütigen Inkubation 1 Mikroliter der Stimulationschemikalie hinzufügen und durch Pipettieren vorsichtig mischen. Nach der Inkubation für die erforderliche Zeit wird das Nährmedium aus der Kulturschale entnommen und 5.000 mal g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugiert, um alle suspendierten Verunreinigungen zu entfernen. Der Überstand wird aus der Zentrifugation aufgefangen und bei Bedarf mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt.