Induktion eines durchdringenden Schädel-Hirn-Traumas bei adulten Drosophila-Fliegen

Nehmen wir zum Beispiel neu geschlüpfte, gentechnisch veränderte adulte Drosophila-Fliegen.

Pilzkörper im Gehirn der Fliege enthalten Neuronen, die grün fluoreszierende Proteine exprimieren.

Pilzkörper sind Strukturen, die komplexe neuronale Netzwerke enthalten, die für Lernen und Gedächtnis unerlässlich sind.

Betäuben Sie die Fliegen auf einem Kohlendioxid-Pad.

Visualisieren Sie unter einem Stereomikroskop, das mit den erforderlichen Filtern ausgestattet ist, die Pilzkörper mit grüner Fluoreszenz

Nimm einen desinfizierten Minutien-Stift und schiebe ihn durch die Kopfkapsel in den Pilzkörper.

Dies führt zu einer Schädigung der Neuronen des Pilzkörpers und einer Störung der neuronalen Netzwerke, was zu einem durchdringenden Schädel-Hirn-Trauma führt.

Entfernen Sie anschließend vorsichtig den Stift aus dem Hosenschlitz.

Legen Sie die verletzten Fliegen in ein Fläschchen mit Futter und lassen Sie sie sich für weitere Untersuchungen erholen.

Nachdem Sie die Fliegen auf einem Kohlendioxid-Pad betäubt haben, sortieren Sie die neu eingeschlossenen F1-Jungfliegen innerhalb von sechs Stunden nach der Eklosion und legen Sie sie in saubere Fläschchen mit Futter mit 40 oder weniger Fliegen pro Fläschchen. Desinfizieren Sie anschließend winzige Stifte, indem Sie etwa 100 Stifte fünf Minuten lang in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen legen, das mit 70 % Ethanol gefüllt ist. Desinfizieren Sie dann das Kohlendioxid-Pad mit einem Pinsel, indem Sie 70 % Ethanol aufsprühen und mit einem sauberen, fusselfreien Tuch trocken wischen.

Sobald die Werkzeuge sauber und trocken sind, übertragen Sie 40 oder weniger sortierte F1-Stecker auf das Reinigungspad und teilen Sie sie in zwei Gruppen auf. Eine Gruppe dient als Kontrolle der unverletzten Fliegen, und die zweite Versuchsgruppe wird einer durchdringenden traumatischen Hirnverletzung unterzogen. Ziehen Sie dann mit einer Pinzette vier bis fünf neue winzige Stifte aus dem Mikrozentrifugenröhrchen und platzieren Sie sie in der Nähe des Randes des Kohlendioxid-Pads. Wählen Sie dann unter dem Präparierbereich einen geraden winzigen Stift mit einer scharfen Spitze. Verwenden Sie scharfe Stifte wieder und legen Sie beschädigte oder stumpfe Stifte zur sicheren Entsorgung in ein separates Röhrchen mit 70 % Ethanol.

Als nächstes schalten Sie bei Fliegen mit dem Standard-Kreuzgenotyp die Stereomikroskop-LED-Lampe ein, die mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionsfiltern für das grün fluoreszierende Protein ausgestattet ist, das eine Anregung bei 440 bis 460 Nanometern und eine Visualisierung bei 500 bis 560 Nanometern ermöglicht. Wählen Sie dann eine Fliege aus der Versuchsgruppe aus und positionieren Sie die Fliege so, dass der Experimentator eine dorsale Ansicht der Kopfkapsel hat, während der Kopf der Fliege nach rechts zeigt. Nehmen Sie mit einer Pinzette den ausgewählten winzigen Stift in die eine Hand und den Pinsel in die andere Hand und halten Sie ihn. Legen Sie dann die Bürste auf die Innenseite des dorsalen Thorax und drücken Sie sie vorsichtig nach unten, um den Hosenschlitz zu stabilisieren.

Zielen Sie mit der Spitze des winzigen Stifts auf die Pilzkörper, Zellkörper auf der rechten Seite des Kopfes, und dringen Sie in die Kopfkapsel ein. Wenn Sie Landmarken verwenden, zielen Sie auf die kutikula des hinteren Kopfes zwischen den Augenflecken und dem dorsalen Rand des Auges ab. Nachdem du die Verletzung abgeschlossen hast, schiebst du den Kopf mit dem Pinsel vorsichtig von der winzigen Nadel ab. Wenn Sie das Gehirn für die RNA-Sequenzierung oder qRT-PCR verwenden, nehmen Sie eine zweite Verletzung auf der linken Seite des Kopfes vor. Sobald alle Versuchsfliegen verletzt sind, legen Sie die Kontroll- und die verletzten Fliegen in separat beschriftete Fläschchen mit Futter.