Name: Verfahren für die Ratte In situ Skeletal Muscle kontraktilen Eigenschaften (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Erfahren Sie die in situ-Methode zur Untersuchung kontraktiler Eigenschaften des Ratten-Skelettmuskels unter physiologischen Bedingungen. Diese Technik ermöglicht präzise Messungen von Kraft, Frequenz und Ermüdung.

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Forschung durch die Natural Science and Engineering Research Council of Canada unterstützt.

Ein. Einführung <ol><li> Die MacIntosh-Labor wurde mit der medialen Gastrocnemius Muskel-Präparat für mehrere Jahre, und davor die ganze gastrocnemius Muskel-Präparat, wie bei Dr. Phil Gardiner entwickelt. 1 </li></ol> 2. Anästhesie <ol><li> Erwachsenen Sprague-Dawley Ratten (200-300 g) werden üblicherweise in unserem Labor für das Studium der kontraktilen Eigenschaften in situ verwendet. Die Ratte in einem Plexiglas-Geräte eingeschränkt werden, im Handel erhältlich, oder durch Abdecken mit einem Handtuch, und halten. </li><li> Wir verwenden Ketamin / Xylazin, (100 mg · ml -1, jeweils) in 85:15 gemischt und Verwalten 0,1 ml pro 100 g Ratten intramuskulär 2,3 Gewichtsprozent. Natriumpentobarbital (50-60 mg · kg -1, intraperiteneal) oder Isofluran (2-3,5%, inhalativen) kann auch 4 verwendet werden. </li><li> Während der Narkose wird mit Wirkung kann eine genaue Gewicht erhalten werden und die linke Hinterpfote Gliedmaßen rasiert. Dies ist auch ein guter time sicher sein, alle Elektronik eingeschaltet und bereit. Dazu zählen auch Rechner, DMS-Messverstärker, Ölheizung und andere. </li><li> Überprüfen Sie für die Rückkehr der Reflex in regelmäßigen Abständen und ergänzen die Narkose nach Bedarf (0,05 bis 0,1 ml pro 100 g). </li></ol> 3. Initiieren Chirurgie <ol><li> Wir verwenden eine Plexiglas-Plattform, auf der die Ratte für eine Operation zu immobilisieren. Einfache Klebeband macht den Job. Achten Sie darauf, das Tier von links Hinterlauf wird nach rechts Vorderbein gestreckt. Fügen Sie einen Tropfen Schmiermittel auf die Augen. Wir verwenden Paraffinöl. Andernfalls werden die Augen austrocknen mit Ketamin-Anästhesie. </li><li> Eine kleine OP-Leuchte ist nützlich. Dieser gibt genug Wärme, um zu helfen das Tier warm. Alternativ kann ein wasserlösliches Wärmedecke verwendet werden. Vergewissern Sie sich, Hornhaut oder Zehen-Pinch-Reflexe fehlen bevor Sie fortfahren. Steriler Technik ist nicht notwendig, da dieses Verfahren akut. Das Tier wird nicht aus der Narkose erholen. Wir einschläfern die Ratte mit BetäubungÜberdosierung (0,2 ml, intrakardialen), wenn alle Prozeduren beendet sind. </li><li> Der erste Einschnitt durch die Haut von der Ferse zur Wirbelsäule. Wir verwenden Schere, da die Tiefe des Schnitts gesteuert werden kann und die Schere verwendet, um die Haut vor den darunter liegenden Geweben zu trennen. Ratten haben exzellente Hämostase, so lange, wie Sie große Blutgefäße zu vermeiden, Blutungen begrenzt. Die offenen Flächen mit isotonischer Kochsalzlösung getränkten Gaze abgedeckt, wann immer möglich. </li><li> Nachdem die Haut von der darunterliegenden Bindegewebes getrennt wird, wird die oberflächliche Muskelschicht geschnitten. Achten Sie darauf, nicht zu gehen zu tief, man will nicht den Ischiasnerv oder Blutgefäßen oder den Muskel von Interesse beschädigen. Beginnen Sie über den Musculus gastrocnemius und schneiden proximal entlang der gleichen Linie wie die Hautschnitt. Peek unter zu finden und zu vermeiden den Ischiasnerv. Sobald Sie sehen, die Nerven haben, können Sie den Weg mit Ihrem Einschnitt folgen, sondern bleiben deutlich über dem Nerv. Es gibt eine klare Naht zwischen muszeuge. Dieses, und entlang dieser Naht in Richtung des Knies. Achten Sie auf und vermeiden Blutgefäße. </li></ol> 4. Bereiten Pilotbohrung in Femur für Knochen pin <ol><li> Durchtrennung der dünnen Schicht des Muskels über die Schwanzvene des Femurs, Aussetzen der blanken Knochen. Verwendung eines handgehaltenen Drehwerkzeug, bohren oder Schiebezange, (0,9 mm Kohlenstoffstahl bur), stellen eine kleine Vorbohrung durch die Rinde, und gerade in die Medulla. Nicht zu tief zu bohren, oder übermäßigen Blutungen führen wird. Dieses Loch wird später verwendet werden, um einen Knochen Pin platzieren, um die Oberschenkel auf dem myograph Basis immobilisieren. </li></ol> 5. Isolieren Innervation des medialen M. gastrocnemius <ol><li> Der nächste Schritt erfordert ein Binokular. Suchen Sie die Stelle, wo der Kniekehle Nerven verschwindet hinter der medialen M. gastrocnemius. Vorsichtig aus die verschiedenen Zweige verteilt, und schneiden Sie alles, was nicht innervieren nicht die mediale Gastrocnemius Muskel. Innervation durch Mikrostimulation bestimmt werden. Auf this der Bühne, auch sicherstellen, dass die oberflächlichen Filialen der Ischiasnerv geschnitten werden. </li><li> Jetzt klar das Bindegewebe vom Ischiasnerv, so kann es in den Nerven Manschette (später) aufgeschoben werden. Achten Sie darauf, um den Nerv zu schonen. Jede Strecke des Nerven kann zu Unerregbarkeit führen und beenden das Experiment vorzeitig. </li></ol> 6. Isolieren Sie die Achillessehne und Gastrocnemius <ol><li> Stumpf mit gelegentlichen Hilfe von Schere, kann die Gastrocnemius-Muskel von anderen Geweben zu trennen. Die Sehne des M. plantaris kann unter der Achillessehne gezogen werden, gebunden und geschnitten. Die Krawatte wird lediglich verwendet, um beim Festhalten der Sehne und kann weggeschnitten werden direkt nach der Sehne geschnitten wird und der ausgewählt ist aus der plantaris gastrocnemius eine wesentliche Länge abgetrennt. Legen Sie eine Nr. 1 Seidenligatur um die Achillessehne und Krawatte in einem quadratischen Knoten. Nicht zu straff zu ziehen, oder die Sehne beschädigt wird. Wir verwenden Knochen rongeurs die calcan geschnitten eus, so dass ein kleines Stück Knochen noch an der Achillessehne befestigt. Halten Sie die Schnittflächen horizontal zu sein, dass die Knochen geschnitten wird, nicht nur die Sehne. Dies gewährleistet die Achillessehne der myograph kann angebracht später. </li><li> Entlang der Unterseite des Gastrocnemius können die Soleus gesehen werden. Auch hier kann stumpf verwendet, um den M. soleus von der M. gastrocnemius zu trennen. Wir wollen die mediale Gastrocnemius isolieren, so ist es der einzige Muskel noch an der Achillessehne befestigt. Schneiden Sie die soleus Sehne, in der Nähe des distalen Ende. Dann können Sie trennen die medialen und lateralen Gastrocnemius Muskeln, und schneiden Sie die seitlichen Sehne, so dass nur die mediale Gastrocnemius an der Achillessehne. Ziehen des Musculus gastrocnemius laterale auswärts von der medialen zusammen etwa 50% seiner Länge. Jenseits dieser Länge schneiden sich die Fasern und Schäden werden von weiterem Ziehen führen. Überprüfen Sie, ob der Muskel ist frei von Bindegewebe. </li></ol>e "&gt; 7. Schneiden Sie die Tibia <ol><li> Legen Sie eine Ligatur um den Schaft, knapp oberhalb der Mitte. Dies muss dicht sein, ohne Eingriff in das Gewebe. Eine zweite Schleife vor dem Heften verhindert ein Verrutschen. Wieder mit einem quadratischen Knoten zu sichern. </li><li> Mit einer kleinen Säge, schneiden Sie die Unterschenkel entfernt. Dieser Schnitt sollte etwa in der Mitte des Schienbeins sein. </li><li> Legen Sie eine scharfe Sonde in der Medulla der Tibia. Diese Sonde wird verwendet, um die Tibia auf der Basis myograph immobilisieren. </li><li> Befestigen 2 Elastiken auf die Haut, mit Michel Clips. Diese und weitere Gummizüge wird verwendet, um die Haut zu halten rund um die Muskel einen Behälter, der mit warmen Paraffinöl gefüllt werden bilden. </li></ol> [OPTIONAL] 8. Legen sonometric Kristalle (optionaler Schritt) 5 <ol><li> Legen Sie das Tier auf einem Heizkissen bei niedrigen Einstellung. Eine Rektalsonde können falls nicht bereits zu diesem Zeitpunkt eingefügten eingefügt werden. Verwenden Sie einen kleinen Tropfen Paraffinöl zu schmieren. </li><li>Verwendung Mikrostimulation, identifizieren die Enden eines fascicle innerhalb des Muskels. Poke eine 21-Gauge-Nadel in die Website sowohl der Ursprung und Ansatz des Muskels. </li><li> Schieben Sie eine sonometric Kristall in das Loch mit der Nadel und Dichtung mit vet-Bindung chirurgische Kleber hergestellt. Verwenden Sie einen sehr kleinen Tropfen Kleber; darauf achten, dass es richtig ist, über den Kristall platziert. Auftragen des Klebstoffs auf einem Stück Papier Schnitt mit einem spitzen Winkel hilft bei der Verklebung genau. Wir setzen ein zusätzliches Einkristall in der Insertion des fascicle welche durch Mikrostimulation identifiziert wurde. </li></ol> [WEITER] 9. Montieren Sie in der Vorrichtung (siehe Abbildung 1) <ol><li> Positionieren Sie die Ratte auf dem myograph Basis, mit dem Tibia-Sonde orientiert Hebel. Legen Sie die Sonde in die Halterung, um das Bein zu immobilisieren. </li><li> Ziehen Sie die Haut an den Seiten, um einen Behälter zu bilden und befestigen Sie sie mit Gummibändern. </li><li> Set Bohrkrone (1/16 inch th) in den Femur, mit dem PilotLoch, das während der OP-Vorbereitung erstellt wurde. Stellen Sie sicher, dass Sie die Oberschenkel auf dem vorderen Teil unterstützt, wie Sie den Bohrer (in einem Stift vice) als Bruch des Oberschenkelknochens platzieren führen kann, endet das Experiment vorzeitig. Bringen Sie den Pin vice zu einem Cross-bar, um die Oberschenkel zu immobilisieren. </li><li> Setzen Sie den distalen Stumpf der Ischiasnerv durch den Nerven stimulierend Manschette (Kathode in Richtung Muskel) und tuck wieder nahe am Ursprung des Muskels. Verbinden Sie den Stimulator auf diese Drähte. </li><li> Bringen Sie die Achillessehne auf den Hebel, die DMS-Sensoren drauf hat. Tie snuggly, aber lassen Sie etwas Platz für eine spätere Einstellung. Sicherstellen, daß die Ausrichtung des Muskels ist senkrecht mit dem Hebel. </li><li> Füllen Sie den Behälter von der Haut mit warmen Paraffinöl gebildet. </li><li> Schalten Sie die Wärmelampe und Position Schilde Alufolie über den Kopf des Tieres gemacht und den Kraftaufnehmer. Zusätzliche Folienabschirmungen kann notwendig sein, um sicherzustellen, die Kerntemperatur des Tieres nicht EXCEed 38 ° C. Die Länge des Muskels kann eingestellt werden, bis Durchhang des Strangs von der Verbindung zwischen den medialen gastrocnemius und den Kraftaufnehmer entfernt wird. </li></ol> 10. Stellen Sie maximale Spannung und Bezugslänge <ol><li> Während der Muskel wird aufgewärmt, richten Sie den Stimulator und testen Sie die Stimulation Spannung. Es ist wichtig zu sein, dass die Stimulation in sehr kurzen Impulsdauer gesetzt wird. Wir verwenden 50 ms. Maximale Spannung sollte weniger als 1 V. Ab 0,5 V, erhöhen Spannung bis twitch Amplitude nicht erhöht. Maximal Spannung ist die niedrigste Spannung, die alle motorischen Einheiten aktiviert. Wir in der Regel auf das Doppelte der maximalen Spannung zu stimulieren, oder 3 V je nachdem, was höher ist. </li><li> Typischerweise werden Experimente mit dem Muskel an der Länge, die den größten twitch Kontraktion gibt beginnen. Ein Zucken ist mit einem einzelnen Stimulationsimpuls erhalten. Der Muskel Länge durch ca. 1 mm für einen anderen twitch erhöht. Dies wird solange wiederholt Amplitude twitchsteigt. Sobald twitch Amplitude abnimmt, wird die Länge zu dem, der die größte Amplitude hat twitch zurückzusenden. </li><li> Nach dieser anfänglichen Einstellung der Länge, testen wir das System mit dem, was wir als eine "Konditionierung tetanische Kontraktion". Der Stimulator wird, um Impulse bei 200 Hz liefern für 500 ms. Lieferung dieses Stimulation wird in einem völlig verschmolzen tetanische Kontraktion führen. Die Kraft, die durch den Muskel erzeugt wird anziehen alle Verbindungen, einschließlich der Knoten auf den Muskel. Nach einer geeigneten Rest für Dissipation Potenzierung 4 ist die Referenzlänge des Muskels zurückgesetzt (siehe Teil 9.2). Normalerweise wird die Klimaanlage tetanische Kontraktion wird einige fascicle Länge Verkürzung erlaubt haben, so der Muskel wird gedehnt ein wenig, um wieder auf die Länge, die den größten Amplitude twitch Kontraktion gibt werden. </li></ol> 11. Initiieren Sie das Experiment <ol><li> Ein typisches Experiment gehören Länge Abgleichent-und / oder Stimulation mit einer Vielzahl von Mustern von Stimulation. Die Datenerhebung kann es sich nur Kraft oder Kraft, mit der Länge, Faszikel Länge und Elektromyogramm. </li></ol> [OPTIONAL] 12. Force-Frequenz-Verhältnis 2 <ol><li> Stellen Sie den Zug Dauer lang genug, um ein Plateau von Gewalt bei einer beliebigen Frequenz von Interesse zu erreichen. Die maximale isometrische Kraft in der medialen gastrocnemius bei 200 Hz erreicht. Zug Dauer muss mindestens 200 ms betragen, mehr ist besser für niedrigere Frequenzen, sondern in gewisser Ermüdungserscheinungen führen, wenn mehrere Kontraktionen verwendet werden, um das gesamte Spektrum der Kraft-Frequenz-Beziehung zu bestimmen. Wir verwenden in der Regel Kontraktionen bei 0, 20, 40, 60, 80, 100 und 200 Hz. Dieser Bereich von Frequenzen ermöglicht die volle Bandbreite der Kraft-Frequenz-Beziehung beschrieben werden. Eine geeignete Pause zwischen den Kontraktionen muss erlaubt Ermüdung zu vermeiden (1-10 min). </li></ol> 13. Force-Länge relationship 6 <ol><li> Wobei die geschätzte optimale Länge festgelegt wurde, kann eine kraftschlüssige Beziehung Länge durch systematische Anpassung der Länge des Muskels von -4 mm bis 4 mm mit einem Servo-Motor-Vorrichtung bestimmt werden. Dies sollte mit maximaler Stimulation (200 Hz) werden, aber wir haben festgestellt, dass sehr kurze Kontraktionen werden das gleiche gilt optimale Länge 7 zu ergeben. Submaximalen Kontraktionen, wie Zuckungen, können verwendet werden, aber dies wird eine unterschiedliche Länge-Abhängigkeit der Stärke 8 zu ergeben. </li><li> Ein wichtiger Aspekt der Bestimmung der Kraft-Länge Beziehung ist die Notwendigkeit, den passiven Kraft am fascicle Länge, bei der die gemessene Kraft tritt abzuschätzen. Aktiven Kraft wird als die Differenz zwischen der gesamten Kraft und der entsprechende passive Kraft berechnet. Da die parallelen elastischen Strukturen der passiven Kraft ertragen und diese sind in Reihe mit den Serie elastischen Strukturen muss die passive Kraft Beitrag zur gesamten Kraft der Reihe abnehmen elastic Strukturen während einer Kontraktion 3 gestreckt. Sobald das passive Kraft für alle relevanten Muskellängen bekannt ist, kann der entsprechende passive Kraft, mit kontinuierlichen Messung der Länge unter Verwendung fascicle sonomicrometry oder durch Schätzung der Übereinstimmung des Messsystems und die In-Reihe-Strukturen des Muskel-Sehnen-Einheit geschätzt werden. Wenn dies nicht geschieht, werden die optimale Länge der Vorbereitung und Kraftspitzen, unterschätzt. </li></ol> 14. Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung 9 <ol><li> Wenn Sie möchten, dass die Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung zu bestimmen, müssen Sie die Kraftaufnehmer zu einem System, das die Kontrolle über entweder Last oder Geschwindigkeit der Längenänderung ermöglicht befestigen. Die einfachste und kostengünstigste Methode ist, um den Luftdruck zu verwenden, um Verkürzung zu einer kontrollierten Last zu beschränken. In unserem System wird der Muskel an dem Hebel auf einer Seite des Drehpunkts befestigt ist und der Luftdruck behindert Längenänderung auf der anderen Seite. Eine Länge Sensor needs auf Arbeitnehmer, so dass Sie in der Lage, um die Änderung im Muskel Länge während isotonische Kontraktionen zu erkennen sind. Diese Anordnung ermöglicht afterloaded Kontraktionen mit pneumatischen Widerstand. Dual-Tanks können isometrische Kontraktion mit Freisetzung in einer isotonischen Belastung ermöglichen. Insgesamt 15-20 Kontraktionen sollte erhalten werden, mit Belastungen von fast unbelasteten maximale isometrische Kraft. Beim Anpassen der Daten an eine Gleichung, sollte Lasten über 90% des nicht isometrische 9 verwendet werden. </li></ol> 15. Repräsentative Ergebnisse: Beispiel Kontraktionen sind in Abbildung 2 dargestellt. Diese Kontraktionen wurden erhalten, um die Kraft-Frequenz-Beziehung zu illustrieren. Berechnung der Peak aktive Kraft dieser Kontraktionen und Auftragen der aktiven Kraft gegen die Frequenz, Abbildung ergibt 3; die Kraft-Frequenz-Beziehung. Die Daten in Abbildung 2 dargestellt, kann der Gleichung angepasst werden: AF = c / (1 + e ((aF) / b) + d); AF ist aktiven Kraft, F Frequenz und a, b, c und d Konstanten sind. Für die Ratte gastrocnemius mediale ist die halbmaximale Frequenz der Stimulation typischerweise 50-60 Hz in nicht ermüdet Muskels 2. Ergebnisse werden eng an der Linie durch die obige Gleichung beschrieben. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 Vorrichtung und Muskel-Set-up:. Pneumatische set-up auf der linken Seite angezeigt, isometrische auf der rechten Seite. Der Hebel-System auf der linken Seite angezeigt wird, um der Übersetzung Tisch befestigt, wenn dynamische Kontraktionen gewünscht werden (in Anlehnung an 13). Der Schrittmotor wird durch einen Computer (aus 14) gesteuert wird. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> . Abbildung 2 Überlagerte isometrische Kontraktionen: 20, 40, 60, 80, 100 und 200 Hz. Die Amplitude des 200 Hz Kontraktion 8,13 N. les/ftp_upload/3167/3167fig3.jpg "/&gt; . Abbildung 3 Force-Frequenz-Verhältnis: Active Kraft der Kontraktionen in Abbildung 2 aufgetragen werden und die Linie repräsentiert die Linie der beste Passform.

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<li>MacNaughton, M. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Length+dependence+of+Fatigue+and+of+Repetitive+Contractions.+Master%27s%22">The Length dependence of Fatigue and of Repetitive Contractions. Master's Thesis</a>. , University of Calgary. (2005).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Gute Qualität kontraktilen Ergebnisse mit Vorsicht in OP-Vorbereitung erhalten werden, sicher in der Vorrichtung und gute Qualität Elektronik Montage. Wenn ein Student lernt diese Operation enthalten einige gemeinsame rutscht: Dehnen der Ischiasnerv, Störung der Durchblutung und starke Blutungen. Der Nerv muss mit Vorsicht behandelt werden, um Schäden zu verhindern. Sie werden wissen, haben die Nerven beschädigt werden, wenn die maximale Kraft bei tetanische optimale Länge ist wesentlich geringer als die in Abbildung 3, oder wenn die Stimulation Spannung benötigt, um zu aktivieren maximal alle Motoreinheiten größer als 5 Volt gezeigt. Es ist relativ einfach, die Blutgefäße dient dieses Muskels während der Operation zu vermeiden. Unterbrechung dieser Gefäße kann auftreten, wenn der Bohrer wird im kaudalen Oberfläche des Oberschenkelknochens gelegt. Wenn die Vorbohrung ist nicht auf die flache Oberfläche des Oberschenkelknochens, kann der Bohrer rutschen. Wenn dies geschieht, besteht die Möglichkeit, dass die Poplitealgefäße gestört zu werden. WennBlutlachen rund um die Muskeln nach dem Set-up, ist es ein Zeichen, dass Sie diese Schiffe gestört. Übermäßige Blutungen können auch auftreten, wenn eine große Vene wird geschnitten und nicht gebunden. Großen Venen aufpassen sind diejenigen, um den Knöchel. Die in situ-Muskel-Präparat ist ein wertvoller Ansatz zur Erforschung des Muskels kontraktilen Eigenschaften. Individuelle motorischen Einheiten können 10 aktiviert werden, aber in der Regel alle motorischen Einheiten synchron aktiviert. Dies ist ein Nachteil gegenüber der Normalen, die durch asynchrone Aktivierung freiwilligen Motoreinheit Rekrutierung auftritt, stellt so eine Einschränkung. Doch auf der positiven Seite, ermöglicht synchrone Ansteuerung Quantifizierung von einer durchschnittlichen Reaktionszeit aller motorischen Einheiten. Es gibt zwei Ansätze, die verwendet wurden, um eine synchrone Aktivierung vermeiden. Eine besteht darin, eine Elektrode Manschette mit mehreren Paaren von stimulierender Leiter verwendet werden. Dies ermöglicht die Aktivierung eines Teils der Motoreinheiten mit jedem Paar,und Stimulation kann durch die Paare drehen, um asynchrone Aktivierung zu erreichen. Diese Methode der Aktivierung kann mit anodischer Block 11 kombiniert werden, um zu versuchen Motoreinheiten in der entsprechenden Reihenfolge zu aktivieren entsprechend der Größe 12 Prinzip. Bei diesem Ansatz werden alle Motoreinheiten mit einem proximalen Paar Elektroden aktiviert wird, und ein Block mit Gleichstrom Stimulation auferlegt. Die Amplitude der Impulse für die Block kann moduliert werden, um Motoreinheiten für die Aktivierung nicht erwünscht ist hemmen. Anscheinend ist der Block betrifft große Axone bei der niedrigsten Spannung und progressiv wirkt kleinere Einheiten. Die in situ-rat gastrocnemius Muskel-Präparat ist eine wertvolle physiologische Ansatz zur Erforschung der Skelettmuskulatur Kontraktion und biochemischen Eigenschaften in Gesundheit und Krankheit.

<table border="1"><tbody><tr><th> Bezeichnung des Geräts </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Haarschneidemaschine </td><td></td><td></td><td> Gute Qualität pet clippers </td></tr><tr><td> Operationsleuchte </td><td> Dyna-Lume </td><td></td><td> Jede von mehreren tun </td></tr><tr><td> Myograph </td><td></td><td></td><td> Custom built </td></tr><tr><td> Stimulator </td><td> Gras </td><td> S-88 </td><td> Jede von mehreren tun </td></tr><tr><td> DMS-Messverstärker </td><td> CWE </td><td> PM-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Registrierfernthermometer </td><td> YSI </td><td> YSI-400 </td><td></td></tr><tr><td> Roboter-Plattform </td><td> Arrick Robotics </td><td> MD-2 </td><td></td></tr><tr><td> Sonometric Verstärker </td><td> Sonometrics </td><td> Sonolab </td><td></td></tr><tr><td> Computer und Datenerfassung </td><td> PC mit NI board </td><td></td><td> Kundenspezifische Software (LabVIEW) </td></tr><tr><td> Heizblock </td><td> Lab-line </td><td> Multi-Block </td><td></td></tr><tr><td> Nervenmanschette </td><td></td><td></td><td> Maßgeschneiderte </td></tr><tr><td> Mikrostimulator </td><td></td><td></td><td> Maßgeschneiderte </td></tr></tbody></table>

verfahren für die ratte<em&gt; in situ</em&gt; skeletal muscle kontraktilen eigenschaften

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Es gibt viele Umstände, in denen es wünschenswert ist, den Kontraktionsreaktion der Skelettmuskulatur unter physiologischen Bedingungen erhalten: normalen Verkehr, intakten ganzen Muskel, bei Körpertemperatur. Dies beinhaltet die Untersuchung der kontraktilen Antworten wie posttetanic Potenzierung, Treppenhaus und Müdigkeit. Darüber hinaus können die Folgen von Krankheit, Nichtgebrauch, Verletzungen, Training und medikamentöse Behandlung von Interesse sein. Dieses Video zeigt, geeignete Verfahren zur Einrichtung und Verwendung dieser wertvollen Muskel-Präparat. Zum Einrichten dieser Vorbereitung, so muss das Tier betäubt, und die mediale M. gastrocnemius wird chirurgisch getrennt, mit der Ursprung intakt. Es muss darauf geachtet, um das Blut und Nerven versorgt zu halten. Ein langer Abschnitt der Ischiasnerv des Bindegewebes gelöscht und durchtrennt proximal. Alle Zweige der distalen Stumpf, die nicht innervieren nicht die mediale Gastrocnemius Muskel durchtrennt werden. Der distale Nervenstumpf ist Inserted in eine Manschette mit Edelstahl-stimulierenden Drähten aufgereiht. Das Fersenbein durchtrennt, so dass ein kleines Stück Knochen noch an der Achillessehne befestigt. Sonometric Kristalle und / oder Elektroden für Elektromyographie eingeführt werden kann. Immobilisierung durch Metall-Sonden in den Femur und Tibia verhindert eine Bewegung des Muskels Ursprungs. Die Achillessehne ist an dem Kraftaufnehmer befestigt ist und das gelöste Haut besteht an den Seiten gezogen wird, um einen Behälter, der mit erwärmtem Paraffinöl gefüllten bilden. Das Öl verteilt die Wärme gleichmäßig und minimiert Verdunstungskälte. Eine Wärmelampe auf den Muskel gerichtet, und der Muskel-und Ratten sind erwärmen gelassen bis 37 ° C. Während es warm ist, können maximale Spannung und die optimale Länge bestimmt werden. Dies sind wichtige Randbedingungen für jedes Experiment auf intakten ganzen Muskel. Das Experiment kann auch die Bestimmung von Standard-kontraktile Eigenschaften, wie die Kraft-Frequenz-Verhältnis, Kraft-length Beziehung und Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung. </p&gt; Mit Sorgfalt bei chirurgischen Isolierung, Immobilisierung des Ursprungs des Muskels und Ausrichtung des Muskel-Sehnen-Einheit mit dem Kraftaufnehmer und richtige Datenanalyse, können qualitativ hochwertige Messungen mit diesem Muskel-Präparat erhalten werden.

Dieses Video zeigt die OP-Vorbereitung und Verfahren benötigt, um die kontraktilen Antworten der Ratte medialen Gastrocnemius Muskel-Präparat zu studieren<em&gt; In situ</em&gt;. Dieses Präparat ermöglicht die Messung der Skelettmuskulatur kontraktilen Eigenschaften unter physiologischen Bedingungen. Das Tier narkotisiert und der Muskel vom umgebenden Gewebe an seinem distalen Ende getrennt. Der Achillessehnenbereich ist mit einem Kraftaufnehmer befestigt, der eine Messung des Muskels Kontraktionsreaktion bei 37 Grad C mit einer intakten Zirkulation.

Verfahren für die Ratte<em&gt; In situ</em&gt; Skeletal Muscle kontraktilen Eigenschaften

Es gibt viele Situationen, in denen es wünschenswert ist, die kontraktile Antwort der Skelettmuskulatur unter physiologischen Bedingungen zu erfassen: normale ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die kontraktilen Eigenschaften der Skelettmuskulatur unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem ein Tier anästhesiert und die motorische Versorgung des interessierenden Muskels chirurgisch isoliert wird. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, das distale Muskelende zu isolieren.Der Muskel wird anschließend in einer Myo-Graft-Apparatur so eingerichtet, dass der Muskelursprung fixiert ist und die Muskelänge auf eine reproduzierbare Bezugsgröße eingestellt wird. Durch Stimulation der motorischen Nerven können Ergebnisse erzielt werden, die grundlegende kontraktile Eigenschaften wie Kraft-Geschwindigkeit, Kraft-Frequenz und Ermüdung oder besondere Eigenschaften im Zusammenhang mit ungewöhnlichen Stimulationsmustern zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie der in-vitro-Beurteilung kontraktiler Eigenschaften, liegt darin, dass die in-situ-Beurteilung die direkte Untersuchung der kontraktilen Muskeleigenschaften bei Körpertemperatur und normalem Blutfluss ermöglicht.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen auf den Gebieten der Muskelmechanik, des Muskelstoffwechsels und der Trainingsphysiologie beantworten, beispielsweise: Welche Mechanismen liegen peripherer Skelettmuskulatur-Ermüdung zugrunde? Welche kurzfristigen Folgen hat eine wiederholte Aktivierung? Die chronische Behandlung von Versuchstieren, beispielsweise durch Training oder Hinterbein-Suspension, gefolgt von der Beurteilung der kontraktilen Eigenschaften, ermöglicht es, die Auswirkungen einer solchen Behandlung auf die kontraktilen Eigenschaften zu bestimmen.Diese In-situ-Methode kann Aufschluss darüber geben, wann sich die kontraktilen Eigenschaften der Skelettmuskulatur verändern. Die kontraktilen Eigenschaften können akut durch wiederholte Aktivierung oder chronisch durch Krankheit, Inaktivität oder Training verändert werden. Die Kontraktionen können isometrisch oder dynamisch sein, und es können Überlegungen zur Muskelänge angestellt werden.Nachdem die ausgewählte Ratte vollständig anästhesiert wurde, fixieren Sie sie mit Klebeband auf einer Plexiglas-Plattform. Geben Sie einen Tropfen Paraffinöl auf die Augen und überprüfen Sie nochmals, dass keine Hornhaut- oder Zehenreflexe vorhanden sind, bevor Sie fortfahren. Aseptische Technik ist nicht erforderlich, da es sich um ein akutes Verfahren handelt.Verwenden Sie nun eine Schere, um durch die rasierte Haut vom Fersenbereich bis zur Wirbelsäule zu schneiden, und lösen Sie die Haut vom darunterliegenden Gewebe ab. Halten Sie die freigelegten Flächen mit isotonischer Kochsalzlösung getränkter Gazetupfer bedeckt. Schneiden Sie proximal durch die oberflächliche Muskulatur über dem Musculus gastrocnemius entlang derselben Linie wie der Hautschnitt. Achten Sie beim Durchtrennen der Muskulatur darauf, den Nervus ischiadicus zu lokalisieren und zu schonen.Verwenden Sie den Verlauf des Nervs als Orientierung für den Schnitt, bleiben Sie jedoch deutlich oberhalb des Nervs. Identifizieren Sie anschließend die klare Naht zwischen den Muskeln und schneiden Sie entlang dieser Naht in Richtung Knie. Achten Sie darauf, keine Blutgefäße zu verletzen.Übermäßiges Bluten oder sogar eine Beschädigung des wesentlichen Blutgefäßes führt zu einer Muskelpräparation, die sich schnell verschlechtert und eine langsame Muskelentspannung aufweist. Entfernen Sie nun das Bindegewebe vom Ischiasnerv, damit dieser in die Nervenmanschette eingeschoben werden kann. Achten Sie darauf, den Nerv schonend zu behandeln.Das Dehnen des Nervs kann zu einer vorzeitigen Erregbarkeit führen und somit das Experiment vorzeitig beenden. Legen Sie eine Ligatur um den Nerv, der proximal zur Ligatur durchtrennt wurde, und klappen Sie den Nerv über den Muskel zurück. Verwenden Sie nun ein handgehaltenes rotierendes Werkzeug, um ein kleines Führungsloch durch die Kortikalis hindurch fast bis in das Mark des Femurs zu bohren.Bohren Sie nicht zu tief, da sonst eine übermäßige Blutung auftreten kann. Vermeiden Sie den Kontakt mit Weichgeweben unter dem Stereomikroskop. Suchen Sie die Stelle, an der der Nervus popliteus hinter dem medialen Musculus gastrocnemius verschwindet.Die verschiedenen Äste vorsichtig auseinanderziehen und den Ast zum lateralen Gastrocnemius durchtrennen. Die übrigen Äste werden durchtrennt, wenn der distale Teil des Beins entfernt wird. Die Innervation kann durch Mikrostimulation bestimmt werden.Schneiden Sie außerdem die oberflächlichen Äste mit einer Schere ab. Schneiden oder dissezieren Sie den Musculus gastrocnemius stumpf, um ihn von anderen Geweben zu trennen. Ziehen Sie die Sehne des Musculus plantaris unter der Achillessehne hervor.Binden Sie es ab und durchtrennen Sie die Sehne. Trennen Sie dann einen beträchtlichen Abschnitt der Plantarsehnen vom Musculus gastrocnemius und entfernen Sie den an der Plantarsehne befestigten Faden. Legen Sie nun eine Seidenligatur Nummer eins um die Achillessehne und binden Sie sie mit einem Quadratknoten fest.Ziehen Sie nicht zu stark, da sonst die Sehne beschädigt wird. Verwenden Sie einen Knochenmeißel, um den Fersenknochen zu durchtrennen, wobei ein kleines Knochenstück an der Achillessehne belassen wird. Halten Sie die Schnittflächen horizontal, um sicherzustellen, dass der Knochen und nicht nur die Sehne durchtrennt wird.Suchen Sie den Musculus soleus an der Unterseite des Musculus gastrocnemius und trennen Sie die beiden Muskeln durch stumpfe Dissektion. Schneiden Sie danach das Sehnenende des Musculus soleus nahe dem distalen Ende durch. Trennen Sie abschließend den medialen und den lateralen Gastrocnemiusmuskel voneinander.Schneiden Sie das seitliche Sehnenband durch, sodass nur noch der mediale Musculus gastrocnemius am Achillessehnenband befestigt ist. Trennen Sie den Musculus gastrocnemius vom Achillessehnenband und legen Sie eine feste Ligatur um den Schaft der Tibia knapp oberhalb der Mitte. Schneiden Sie dabei nicht in das Gewebe ein. Führen Sie eine zweite Schlaufe durch, um ein Verrutschen zu verhindern, und sichern Sie die Ligatur mit einem Doppelknoten.Verwenden Sie nun eine kleine Säge, um das Unterschenkelbein in der Mitte der Tibia abzuschneiden. Stecken Sie dann eine scharfe Sonde in das Mark der Tibia. Befestigen Sie mit Hilfe von Michel-Klammern zwei Gummibänder daran, die verwendet werden, um die Haut um den Muskel herum nach oben zu halten und so einen Behälter für Paraffinöl zu bilden.Platzieren Sie die Ratte auf der Myo-Graft-Basis und fixieren Sie ihr Bein, indem Sie die Tibia-Sonde in Richtung des Hebels ausrichten und in der Halterung befestigen. Ziehen Sie nun die Haut an den Seiten nach oben, um einen Behälter zu bilden, und sichern Sie die Haut mit Gummibändern. Stützen Sie den Femur auf der vorderen Seite ab und setzen Sie einen Bohrer in den Femur ein.Befestigen Sie den Bohrer an einer Querstange. Führen Sie anschließend den distalen Stumpf des Nervus ischiadicus durch die nervenstimulierende Manschette. Legen Sie ihn dicht an der Muskelansatzstelle an und verbinden Sie den Stimulator mit den Drähten der Nervenmanschette.Befestigen Sie die Achillessehne am Hebel. Binden Sie sie fest, wobei etwas Spiel für spätere Einstellungen verbleibt. Richten Sie dann den Muskel senkrecht zum Hebel aus.Füllen Sie nun den durch die Haut gebildeten Behälter mit erwärmtem Paraffinöl und positionieren Sie eine Wärmelampe über dem Tier, um sicherzustellen, dass die Kerntemperatur des Tieres 38 Grad Celsius nicht überschreitet. Legen Sie Folienblätter zwischen die Wärmelampe und den Kraftaufnehmer sowie zwischen den Kopf der Ratte und die Wärmelampe. Der letzte Schritt bei dieser Vorbereitung besteht darin, die Länge des Muskels so einzustellen, dass beim Aufwärmen des Muskels keine Schlaffheit im Verbindungsfaden zwischen dem Musculus gastrocnemius medialis und dem Kraftaufnehmer vorhanden ist.Stellen Sie die Impulsdauer des Stimulators auf 50 Mikrosekunden und 0,5 Volt ein. Stimulieren Sie nun den Muskel in Abständen von acht bis zwölf Sekunden. Erhöhen Sie die Spannung schrittweise, bis die Zuckungsamplitude einen Plateauzustand erreicht.Das Plateau tritt bei der maximalen Spannung auf, und sofern der Nerv nicht beschädigt ist, sollte diese vorwärts gerichtet weniger als 1,5 Volt betragen; stimulieren Sie mit der doppelten maximalen Spannung, um die Aktivierung aller motorischen Einheiten sicherzustellen. Erhöhen Sie anschließend die Muskellänge in Schritten von einem Millimeter und messen Sie jeweils die Kontraktionsamplitude bei jeder Länge. Verwenden Sie eine Doppelpulsstimulation mit 200 Hertz, sobald die Länge ermittelt ist, die die maximale Kontraktionsamplitude liefert.Stellen Sie den Muskel auf diese Länge ein. Stellen Sie nun den Stimulator so ein, dass er für 500 Millisekunden Impulse mit 200 Hertz abgibt, um eine vollständig fusionierte tetanische Kontraktion zu erzeugen. Dadurch verfestigen sich alle Muskelverbindungen, einschließlich der Verspannungen im Muskel. Bestimmen Sie anschließend die Referenzlänge erneut, und der Muskel ist für die Experimentierung bereit.Diese Kontraktionen wurden aufgezeichnet, um die Beziehung zwischen Kraft und Frequenz zu veranschaulichen. Durch Berechnung der maximalen aktiven Kraft dieser Kontraktionen und Auftragen der aktiven Kraft gegen die Frequenz ergab sich diese Kraft-Frequenz-Beziehung. Die Daten können in die auf dem Bildschirm dargestellte Gleichung angepasst werden, wobei AF die aktive Kraft, F die Frequenz und A, B, C und D Konstanten sind.Diese Gleichung ergibt eine Gerade, die gut an die Daten angepasst ist. Nachdem die chirurgische Technik und der Versuchsaufbau beherrscht wurden, können sie innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden, aber versuchen Sie während des Verfahrens nicht, daraus einen Wettbewerb zu machen. Nach Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, den Narkosezustand des Tieres regelmäßig zu überprüfen.Andere Messungen wie die EMG, die Durchblutung oder die biochemische Beurteilung können durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise: Ist die Membranerregbarkeit verringert worden? Sind die Energiereserven erschöpft oder ist die Durchblutung beeinträchtigt worden?

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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