In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

Biolumineszenz-Bildgebung des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1α Aktivität wird angewandt, um intrakranielle Tumorhypoxie Entwicklung in einer Brustkrebs Hirnmetastasen Mausmodell zu überwachen.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Tumorhypoxiedynamik bei orthotopen Brustkrebs-Hirnmetastasen in einem Mausmodell nicht-invasiv zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem Brustkrebszellen MDA MB 2 31 mit dem Hypoxie-Reporterkonstrukt stabil transduziert werden. Anschließend werden in vitro Luciferase-Assays verwendet, um eine erfolgreiche Transfektion und Expression des Hypoxie-Reporterkonstrukts sicherzustellen.

Als nächstes wird eine in vivo Biolumineszenz-Bildgebung durchgeführt, um longitudinale Veränderungen der Tumorhypoxie der intrakraniellen Metastasen zu überwachen. Die Ergebnisse zeigen die Initiierung und Evolution der Tumorhypoxie von Brustkrebs-Hirnmetastasen basierend auf der Biolumineszenz-Bildgebung des Expressionsmusters des Hypoxie-Reportergens. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der EOL-Sauerstoffelektrode besteht darin, dass diese Materie völlig nicht-invasiv ist und eine Inva-Überwachung der dynamischen Veränderung in Längsrichtung ermöglicht.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose von Hirntumoren, da die Tumorhypoxie die Wirksamkeit der konventionellen Therapie wie der Bestrahlung verringert. Daher ist die Erkennung des Ausmaßes der Tumorhypoxie hilfreich bei der Gestaltung therapeutischer Interventionen. Erste Kultur, die MDA MB 2 3 1 5 H-R-E-O-D-D Luziferase-Zellen, bei denen es sich um eine humane metastasierende Brustkrebszelllinie handelt, stabil transfiziert mit einem neuartigen HIF-alpha-abhängigen Reporto-Gen in supplementiertem DMEM-Medium für die in vitro HIF eine Alpha-Biolumineszenz-Assay-Platte dreimal 10 zu den fünf MDA MB 2 3 1 5 H-R-E-O-D-D-D-Luziferase-Zellen in jeder Vertiefung von zwei Sechs-Well-Platten inkubieren die Zellen über Nacht in einem Der Gewebekultur-Inkubator ist auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt, damit sich die Zellen an die Schale anheften können.

Am nächsten Tag. Legen Sie eine der sechs Well-Platten zusammen mit einer Schale mit 10 bis 20 Millilitern sterilem Wasser in die Hypoxiekammer, um eine EVA-Aberration der Kulturen zu verhindern. Die zweite Platte verbleibt im Gewebekultur-Inkubator bei 21 % Sauerstoff und dient als Normoxie-Kontrolle.

Verbinden Sie den Einlassschlauch mit einer Gasflasche, die 0,1 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid und 94,9 % Stickstoff enthält. Öffnen Sie sowohl die Einlass- als auch die Aussichtsklemmen und begasen Sie die Hypoxiekammer, um eine Sauerstoffkonzentration von 0,1 % zu erreichen. Trennen Sie die Gasquelle und verschließen Sie die Kammer, indem Sie die Kunststoffklemmen schließen.

Stellen Sie die Kammer dann für 24 Stunden in den Gewebekultur-Inkubator. Führen Sie nach 24 Stunden den Biolumineszenz-Assay durch, aspirieren Sie zunächst das Medium von beiden Sechs-Well-Platten und waschen Sie die Zellen zweimal schnell mit eiskaltem PBS. Fügen Sie dann einen Milliliter revidiertes kaltes PBS hinzu, das 100 Mikroliter Luzifer in Lumineszenzbildern enthält, wobei das Enogen-Spektrum des Messschiebers mit Belichtungszeiten von 1, 30, 60 und 180 Sekunden verwendet wird.

Messen Sie die Intensität der Biolumineszenz in jeder Vertiefung mit einer lebenden Bildgebungssoftware am Tag der intrakraniellen Injektion und ernten Sie die MDA MB 2 3 1 5 H-R-E-O-D-D-D-Luziferase-Zellen bei 80 % Konfluenz durch Trypsin und Zentrifugation. Suspendieren Sie das Pellet wieder in frischem, mittlerem Zustand und führen Sie eine Zellzählung durch. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 10 auf die fünf Zellen in einem Volumen von vier Mikrolitern und legen Sie die resuspendierten Zellen nach der Betäubung auf Eis.

Vier bis sechs Wochen alte weibliche Nacktmäuse mit 3%Eis Fluor gemischt mit Sauerstoff. In einer Induktionskammer wird das Tier in einen Nasenkegel gebracht, in dem 2 % Fluor verabreicht werden, um die Narkose aufrechtzuerhalten, und die Kopfhaut durch Abwischen mit Betadinlösung und dann mit 70 % Alkohol sterilisieren. Führen Sie anschließend mit einem scharfen Skalpell einen Schnitt in der Mittellinie durch und legen Sie die rechte Hemisphäre des Schädels frei.

Identifizieren Sie den Punkt, der einen Millimeter vor der Koronalnaht und zwei Millimeter lateral der sagittalen Naht liegt. Verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeitsbohrer, um ein Loch von einem Millimeter zu bohren. Ziehen Sie zu diesem Zeitpunkt die vier Mikroliter Zellsuspension in eine 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze.

Ausgestattet mit einer 32-Gauge-Hamilton-Nadel. Positionieren Sie die Hamilton-Spritze über dem Loch im Schädel. Führen Sie die Spitze der Nadel vorsichtig einen Millimeter unterhalb des URA mater ein.

Sobald diese Tiefe erreicht ist, drücken Sie vorsichtig auf den Kolben der Spritze, um die Zellen direkt in den rechten Korridor zu injizieren. D kelon. Sobald die Zellen injiziert wurden, warten Sie etwa 30 Sekunden und ziehen Sie dann die Nadel vorsichtig zurück.

Füllen Sie das Bohrloch mit Knochen, verschließen Sie die Kopfhaut mit resorbierbaren Nähten und sterilisieren Sie die Region mit 70%igem Alkohol. Verabreichen Sie die erste Buprenorphin-Injektion zur Analgesie. Buprenorphin-Analgesie wird zwei Tage lang alle 12 Stunden verabreicht.

Stellen Sie sicher, dass sich das Tier vollständig von der Narkose erholt hat. Kehren Sie dann in den Heimatkäfig zurück. Zwei Wochen nach der intrakraniellen Implantation der Zellen wird die longitudinale Biolumineszenz mit dem ivus-Spektrum-System eingeleitet.

Nach gleichzeitiger Betäubung von drei Mäusen mit 3%isof, Fluor und Sauerstoff. Verabreichen Sie eine Lösung von 120 Milligramm pro Kilogramm Luzifer in einem Gesamtvolumen von 80 Mikrolitern in den Nacken. Stellen Sie unmittelbar nach der Verabreichung der Injektion einen Timer auf fünf Minuten.

Setzen Sie die Mäuse in die Bildgebungskammer und halten Sie die Anästhesie mit 1 % isof, Fluor und Sauerstoff bei einer Flussrate von einem Kubikdezimeter pro Minute aufrecht. Nach Ablauf von fünf Minuten seit der luziferischen Injektion. Erfassen Sie Biolumineszenzbilder mit Belichtungszeiten von 1, 30, 60 und 180 Sekunden.

Nachdem Sie das endgültige Bild aufgenommen haben, nehmen Sie die Tiere aus der Kammer und setzen Sie sie zurück in den Heimkäfig, damit sie sich von der Narkose erholen können. Analysieren Sie die Daten mit der Live-Imaging-Software, zeichnen Sie manuell einen interessierenden Bereich, um das Biolumineszenzsignal zu skizzieren, und verwenden Sie dann absolute Photonenzählungen pro Sekunde, um die Intensität des Signals zu quantifizieren. Wiederholen Sie die Biolumineszenz-Bildgebung einmal pro Woche für acht bis 10 Wochen.

Unmittelbar nach der letzten Sitzung der Biolumineszenz-Bildgebung wird der Hypoxie-Marker piol verabreicht und die Mäuse geopfert. Eine Stunde später, nachdem das gesamte Gehirn aus dem Gefrierschrank mit optimaler Schnitttemperatur entfernt und eingefroren wurde, wurde der Gefrierschrank mit einer Temperatur von minus 80 Grad Celsius eingefroren. Anschließende histologische krestale Violettfärbung und immunhistochemische Färbung gegen Luciferase-Hypoxie.

Marker OLE und H one alpha wird durchgeführt, um bildgebende Beobachtungen zu validieren. Dieses Bild zeigt repräsentative Ergebnisse des in vitro HIF one alpha Biolumineszenz-Assays. Die Maßstabsleiste auf der rechten Seite wird von unten nach oben angezeigt.

Die Pseudofarbveränderungen, die mit zunehmender Biolumineszenz verbunden sind. Die oberen beiden Vertiefungen von MDAM 2 3 1 5 HEDD Luziferzellen wurden unter hypoxischen Bedingungen aufbewahrt. Gemäß dem in diesem Videoartikel beschriebenen Verfahren zeigt die grüne Farbe eine erhöhte Transkription des Luciferase-Reporters aus dem HIF-Eins-Alpha-Promotor als Reaktion auf hypoxische Bedingungen an.

Die unteren beiden Vertiefungen sind Kontrollvertiefungen, die unter Normoxie gehalten wurden und nur sehr geringe Mengen an Biolumineszenz emittierten. Dieses Bild zeigt die Ergebnisse der longitudinalen in vivo Biolumineszenz-Bildgebung der Tumorhypoxie-Dynamik. Das gleiche Tier wurde einmal wöchentlich von fünf bis 10 Wochen nach intrakranieller Verabreichung von M-D-A-M-B 2 31 5 H-R-E-O-D-D-D-Luziferase-Zellen abgebildet.

Zunächst wurde ein schwaches Lichtsignal von der rechten Seite des Mäusegehirns sichtbar gemacht. Fünf Wochen nach intrakranieller Implantation der Brustkrebszellen wurde über weitere sechs Wochen ein erhöhtes optisches Signal beobachtet, das auf eine erhöhte Tumorhypoxie hinweist. Dieses Diagramm zeigt die Zeitverlaufskurve der quantitativen Photonenzahlen des Lichtsignals über die sechs Wochen der Bildgebung.

Dieses Bild zeigt einen 10-Mikron-Schnitt eines gefrorenen Mausgehirns mit einer Metastasierung von Brustkrebs-Immunfärbung mit dem hypoxischen Marker pi Monosol al intratumorale Heterogenität der Hypoxie ist hier offensichtlich, derselbe Schnitt wie bei der Immunfärbung mit Anti-Luciferase-Antikörper. Dieses Überlagerungsbild zeigt, dass die intratumorale Heterogenität der Hypoxie räumlich mit der Luziferexpression korreliert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Biobiolumineszenz-Bildgebung anwenden können, um die Dynamik der intrakraniellen Hypoxie von Tumoren basierend auf ihrem über Hypoxie berichteten Gen HRE-Aussehen zu überwachen.